Зберігання цукрових буряків для виробництва біопалива з використанням біоконтрольних мікроорганізмів (частина 3)

 

За матеріалами наукової статті в рамках дослідницької програми MicroDrivE на тему «Зберігання цукрових буряків для виробництва біопалива з використанням біоконтрольних мікроорганізмів» («Storage of sugar beets for biofuel production using biocontrol microorganisms») Кафедри мікробіології Шведського університету сільськогосподарських наук.

Чотири місяці зберігання при 15°С

Зразки, які зберігалися чотири місяці при 15°С, мали найбільшу кількість бактерій та цвілі після ферментації (Таблиця 9). Кількість дріжджів, стійких до циклогексиміду, була навіть більшою, ніж у ферментації зразків, які зберігалися при 10°С протягом чотирьох місяців. Вища температура зберігання стимулювала ріст дріжджів, бактерій та цвілі. Ріст S. cerevisiae J672, можливо, був сповільнений в деяких зразках, де виявлена кількість зменшилася від кількості інокульованих організмів — 2·107 КУО/мл.

Таблиця 9. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів для ферментації зразків, які зберігалися при 14°С та протягом 4 місяців, через 42 год.

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі, стійкі до циклогексиміду* S. cerevisiae
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Цукрові буряки до зберігання

<10
<10
5,6Е+08
5,8Е+08
7,0Е+08
9,0Е+08
5,8Е+08
54,5Е+08
5,5Е+08
<10

7,0Е+03
1,9Е+07
9,5Е+05
2,1Е+07
5,1Е+06
1,6Е+07
1,2Е+07
1,2Е+07
4,1Е+06
<10

3,0Е+07
3,4Е+07
1,5Е+07
1,0Е+07
2,5Е+07
2,8Е+07
7,7Е+07
2,8Е+07
3,2Е+07
7,4Е+07

Висновки з визначення кількості життєздатних мікроорганізмів зразків ферментації

Більш тривалий період зберігання та вища температура стимулювали ріст ендогенних бактерій, дріжджів та цвілі. Біоконтрольні організми не гальмували ріст ендогенних та шкідливих мікроорганізмів у зразках, які зберігалися протягом чотирьох місяців, їх ріст значно прискорився, порівняно з неінокульованими зразками (D-F). Основною причиною відсутності виходу етанолу була відсутність цукру в зразках на зберіганні, а збільшення шкідливих мікроорганізмів не покращило ситуацію. Ріст S. cerevisiae був найбільш інтенсивним у зразках із високим виходом етанолу. Це співвідноситися з тим, що виробництво етанолу тісно пов’язане з ростом дріжджових клітин. Інтенсивний ріст дріжджів, стійких до циклогексиміду, у зразках, неінокульованих C. oleophila JÄ3, свідчить про те, що C. oleophila або деякі інші стійкі до циклогексиміду дріжджі природним чином виявляються в цукрових буряках, використаних у цьому дослідженні.

Геномна ідентифікація

На жаль, результати цих аналізів були неоднозначними.

Виробництво газу

Графік виходу накопиченого метану дає інформацію про виробництво метану протягом тривалого періоду. Кінцеве значення дають інформацію про загальний потенціал виробництва метану для кожної інокуляції, тобто скільки метану можна отримати з субстрату.

Один місяць зберігання

Зберігання при 10°С

На Графіку 6 показана чітка різниця в обсягах виробництва. Інокуляція біоконтрольним організмом P. fluoresence KJ36 зразків G-I, здається, зменшила початкові показники виробництва. Натомість, виробництво, здається, триватиме довше, 36 днів, і для деяких зразків дається більший потенціал виробництва метану, на відміну від інших способів інокуляції (Таблиця 10). Концентрації VFA для зразків G-I виявилися меншими за межу виявлення (див. Таблицю 3). В іншому випадку, високі концентрації VFA можуть бути поясненням скорочення обсягів виробництва, отже, високий рівень VFA пригнічує метаногенез. Тому, схоже, що інокуляція P. fluorescence KJ36 зменшила початковий рівень виробництва метану, що дозволяє припустити те, що біомаса з P. fluorescence KJ36 повільніше розщеплюється. Раптовий приріст виділення метану на 30 день для зразків D-F, J-K і цукрових буряків до зберігання можна пояснити фоновим виробництвом.

Цукрові буряки легко засвоюються біогазовими організмами, і схоже, що розщеплення ендогенного матеріалу з інокуляту не починається, допоки не засвоються цукрові буряки. Тому потенціал виробництва метану для зразків D-F, J-K та цукрових буряків до зберігання визначався на 27 день, а зразків G-I — на 36 день.

Зберігання при 15°С

Інокуляція P. fluoresence KJ36 мала вплив на потенціал виробництва метану зразків, які зберігалися протягом одного місяця при 15°C (Графік 7). Виробництво метану зі зразків G-I затримувалося на початку дослідження та протягом усього експерименту, тому їх потенціал менший, порівняно з іншими зразками (Таблиця 10). Виробництво газу зі зразка Н затримувалося так само, як і зі зразків з однаковою інокуляцією, які зберігалися при 10°С, тоді як зразки G та I мали ще більші затримки, ніж відповідні зразки, які зберігалися при 10° С. Зразки G та I містили більшу кількість VFA (Таблиця 3), що передбачає можливе гальмування метаногенезу через зниження рівня рН, викликаного кислотами. Потенціал виробництва метану зразка буряків до зберігання, а також зразків D-F та J-K визначався на 29-й день, а зразків G-I — на 37-й день.

Графік 6. Вихід накопиченого метану в N мл/г VS, фонове виробництво не враховується, 1 місяць зберігання при 10°С. Кожна інокуляція — це середнє арифметичне дубльованих зразків, а вихід накопиченого метану стандартизовано до 0°С та 1 атм.

Графік 7. Вихід накопиченого метану в N мл/г VS, фонове виробництво не враховується, 1 місяць зберігання при 15°С. Кожна інокуляція — це середнє арифметичне дубльованих зразків, а вихід накопиченого метану стандартизовано до 0°С та 1 атм.

Чотири місяці зберігання

Зберігання при 10°С

Зразки, інокульовані P. fluoresence KJ36, виявили найбільшу затримку, порівняно з дигеруванням відповідних зразків, які зберігалися протягом одного місяця (Графік 8). Ці зразки також мали більшу концентрацію VFA (Таблиця 3), що свідчить про можливе пригнічення метаногенезу через зниження рівня рН, викликаного кислотами. Також існувала набагато більша різниця між іншими зразками (D-F, J-L та цукровими буряками до зберігання), порівняно з попередніми експериментами. Потенціал виробництва метану зразків D-F, J, L та цукрових буряків до зберігання визначали на 29 день, зразків G-I — на 45 день, а зразка К — на день 33 день (Таблиця 10).

Зберігання при 15°С

Потенціал виробництва метану зразків цукрових буряків, що зберігалися чотири місяці при 15°С, показано в Таблиці 10. Анаеробне дигерування зразків цукрових буряків G та H, які зберігалися чотири місяці при 15°С, все ще продовжується (Графік 9). Зразки G-I, інокульовані P. fluoresence, майже не відрізняються від інших зразків, на відміну від попередніх анаеробних дигерувань. Загалом, виробництво метану з усіх зразків відбувається повільніше, порівняно з попередніми анаеробними дигеруваннями. Тому потенціал виробництва метану зразків D-F, J, L та цукрових буряків до зберігання визначався на 35 день, зразка I — на 44 день, тоді як у зразках G та H дигерування продовжувалося в останній 57 день.

Графік 8. Вихід накопиченого метану в N мл/г VS, фонове виробництво не враховується, 4 місяці зберігання при 10°С. Кожна інокуляція — це середнє арифметичне дубльованих зразків, а вихід накопиченого метану стандартизовано до 0°С та 1 атм.

Графік 9. Вихід накопиченого метану в N мл/г VS, фонове виробництво не враховується, 4 місяці зберігання при 15°С. Кожна інокуляція — це середнє арифметичне дубльованих зразків, а вихід накопиченого метану стандартизовано до 0°С та 1 атм.

Вихід накопиченого метану

Виробництво метану на 1 г VS дає інформацію про потенціал виробництва метану зразків, порівняно з виділенням метану зі свіжої маси, що дає інформацію про наявність втрат потенціалу під час зберігання. Важливо враховувати і те, й інше; в іншому випадку, якщо аналізується тільки виробництво метану на 1 г VS, зразок, що зберігався протягом чотирьох місяців, здається кращим за зразок цукрових буряків до зберігання.

Вихід метану зі зразків цукрових буряків до зберігання виявився трохи нижчим за 413 N мл/г VS і 80 N мл/г свіжої маси, вказані в літературних джерелах.

Таблиця 10. Вихід накопиченого метану на 1 г VS та 1 г свіжої маси (WW), стандартизовано до 0°С та 1 атм. Фонове виробництво не враховується.

Зразок Вихід накопиченого метану (N мл/г VS) Вихід накопиченого метану (N мл/г WW)
1 місяць 4 місяці 1 місяць 4 місяці
10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С
D
E
F
G
H
I
J
K
L

333
303
330
345
401
367
359
351
332

313
331
310
258
322
274
313
334
351

356
416
402
288
257
207
358
530
398

368
439
379
530
538
416
440
441
427

55
49
55
54
61
54
63
54
58

50
46
49
37
36
43
51
42
56

42
33
43
18
27
17
39
23
38

28
22
19
17
20
14
17
13
15

Середнє значення 347 312 357 442 56 46 34 18
Цукрові буряки до зберігання 328 311 354 327 62 58 58 37

Вища температура та довший період зберігання зменшили вихід метану зі свіжої маси (Таблиця 10), що відповідало зменшенню вмісту летючої твердої речовини (VS) під час зберігання (Таблиця 4). Менший вміст VS означає менший вміст вуглецю а, отже, меншу його доступність для виробництва метану, що також залежало від зменшення вмісту цукру під час зберігання. Вуглецеві сполуки поглиналися клітинним диханням цукрових буряків, ростом біоконтрольних та шкідливих мікроорганізмів.

Стосовно біоконтрольних організмів, C. oleophila JÄ3 (зразки J-L) виявилася кращою за P. fluoresence KJ36 (зразки G-I). Тому, зі зразків G-I було вироблено менше метану, ніж зі зразків J-L.

Інша відмінність зразків G-I, інокульованих P. fluoresence KJ36, від інших зразків полягала в тому, що вміст метану у виробленому біогазі не досягав 50-60% до 20-го дня, порівняно з 10-м днем для інших зразків (дані не вказані). Однак це не стосувалося зразків, які зберігалися при 15°С протягом чотирьох місяців, коли жоден із них не досягнув концентрації метану 50-60% до 20 дня (дані не вказані). Це також показано на кривих накопиченого метану на Графіках 6-9, де у зразках G-I затрималися перші три дигерування, тоді як в останньому експерименті накопичення метану відбувалося повільніше від усіх інших інокуляцій.

Виробництво накопиченого біогазу

Виробництво накопиченого біогазу на 1 г VS та 1 г свіжої маси показано в Таблиці 11, а на Графіку 10 зображено виробництво біогазу зі зразків, які зберігалися при 10°С.

Виробництво накопиченого біогазу було аналогічним до виробництва метану, трохи меншим зі зразка цукрових буряків до зберігання, порівняно з літературними даними — 787 N мл/г VS та 150 N м/л г свіжої маси. Виробництво біогазу на 1 г свіжої маси дає, як і виробництво метану, більш точні значення для аналізу, ніж виробництво на 1 г VS.

Виробництво накопиченого біогазу слідує за виробництвом накопиченого метану, що показано на Графіку 10.

Таблиця 11. Вихід накопиченого біогазу на 1 г VS та 1 г свіжої маси (WW), стандартизовано до 0°С та 1 атм. Фонове виробництво не враховується.

Зразок Вихід накопиченого біогазу (N мл/г VS) Вихід накопиченого біогазу (N мл/г WW)
1 місяць 4 місяці 1 місяць 4 місяці
10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С
D
E
F
G
H
I
J
K
L

833
715
790
770
895
860
825
793
781

760
780
753
471
653
473
739
790
804

760
876
837
657
550
480
741
1107
833

776
997
872
1192
1205
1003
992
1048
1028

132
103
127
115
130
122
139
116
131

114
100
114
64
75
68
113
92
122

85
64
84
39
54
36
74
41
73

59
45
43
34
40
30
35
29
34

Середнє значення 807 691 760 1013 124 96 67 39
Цукрові буряки до зберігання 776 643 687 463 142 116 121 71

Графік 10. Вихід накопиченого біогазу без фонового виробництва, 1 місяць зберігання при 10°С. Кожна інокуляція — це середнє арифметичне дубльованих зразків, а вихід накопиченого біогазу стандартизовано до 0°С та 1 атм.

Висновки

Метою дослідження було визначити, чи можна подовжити тривалість зберігання цукрових буряків за допомогою використання біоконтрольних організмів Candida oleophila JÄ3 або Pseudomonas fluoresence KJ36. Було визначено вплив біоконтрольних організмів на вміст цукру, ріст шкідливих мікроорганізмів, вихід біогазу та етанолу.

Біозахист не працював, оскільки біоконтрольні організми не пригнічували ріст шкідливих організмів. Збільшилася кількість ендогенних бактерій, і тому, схоже, що біоконтрольні організми на поверхні цукрових буряків жодним чином на них не впливали, а розвиток цвілі на поверхні коренів не притуплювався.

Біоконтрольні агенти не перешкоджали зниженню вмісту цукру або перетворенню сахарози в глюкозу та фруктозу під час зберігання; зі зменшенням вмісту цукру і з плином часу частка глюкози та фруктози збільшувалася. Однак не можна виключити можливість того, що сахароза могла перетворитися на інші цукри, крім глюкози та фруктози. Температура та тривалість зберігання мали значний вплив на вміст цукру, оскільки він зменшився у всіх зразках.

Зменшення вмісту цукру відповідає зменшенню значень TS та VS. При 15°С було використано більше органічного матеріалу, ніж при 10°С. Вуглецеві сполуки, швидше за все, поглиналися клітинним диханням цукрових буряків, а також ростом біоконтрольних та шкідливих мікроорганізмів.

Зниження значення VS вказує на меншу доступність вуглецю для виробництва метану, а отже, виробництво на 1 г свіжої маси з часом зменшувалося. Крім того, зі зразків, інокульованих будь-яким із двох біоконтрольних організмів, було отримано менше метану, порівняно з неінокульованими зразками. У зразках, інокульованих P. fluorescence KJ 36, накопичення метану відбувалося повільніше у всіх експериментах, за винятком зразків, які зберігалися 4 місяці при 15°C.

Температура мала незначний вплив на вихід етанолу зі зразків, які зберігалися протягом одного місяця. Жодна інокуляціє не виявилася кращою за неінокульовані зразки. Біоконтрольні організми значно знизили вихід етанолу за рахунок зменшення вмісту цукру в зразках, які зберігалися протягом чотирьох місяців. Основною причиною відсутності виходу етанолу є відсутність цукру в зразках на зберіганні, проте ріст шкідливих організмів не змінював цю ситуацію.

Порівняно з виробництвом етанолу, зберігання не мало такого ж значного впливу на виробництво біогазу. Отже, виробництво біогазу менше залежить від концентрації сахарози, глюкози та фруктози, на відміну від ферментації етанолу.

Із даного дослідження можна зробити висновок, що біозахисні організми Pseudomonas fluoresence KJ36 та Candida oleophila JÄ3 не пригнічували розвиток різних грибкових збудників. Відповідно, їх вплив на вміст цукру, а отже, і на виробництво етанолу був негативним. Виробництво біогазу зменшилося за рахунок поглинання органічних речовин біоконтрольними та шкідливими мікроорганізмами. Тривалість зберігання цукрових буряків не можна подовжити за допомогою біоконтрольних організмів Pseudomonas fluorescens KJ36 та Candida oleophila JÄ3.

Додаток І

Мікробний ріст під час зберігання цукрових буряків

Таблиця 12. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів через 1 місяць

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі Цвіль

 

D
E
F
G
H
I
J
K
L

10°С

1,1Е+08
6,0Е+07
1,8Е+08
1.0Е+08
4,0Е+07
7,5Е+07
2,4Е+07
1,9Е+07
5,7Е+07

15°С

8,7Е+07
1,6Е+08
3,2Е+08
1,0Е+08
4,0Е+07
7,5Е+07
2,4Е+07
1,9Е+07
5,7Е+07

10°С

5,4Е+05
9,1Е+05
1,0Е+05
9,7Е+06
4,7Е+06
2,0Е+07
1,6Е+08
1,0Е+08
1,1Е+08

15°С

3,6Е+05
3,4Е+06
2,0Е+05
1,2Е+08
2,0Е+07
1,1Е+08
2,1Е+08
4,1Е+08
1,9Е+08

10°С

1,3Е+04
5,0Е+04
2,4Е+07
<1,0Е+04
6,5Е+04
1,3Е+07
<1,0Е+04
<1,0Е+04
1,1Е+06

15°С

7,0Е+04
4Е+04
1,1Е+07
5,0Е+05
1,9Е+06
2,0Е+07
0<1,0Е+04
<1,0Е+04
<1,0Е+04

Таблиця 13. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів через 4 місяці

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі Цвіль

 

D
E
F
G
H
I
J
K
L

10°C

4,6Е+07
9,0Е+05
4,2Е+06
<1,0Е+05
<1,0Е+05
8,0Е+04
3,6Е+06
9,0Е+05
1,5Е+07

15°C

1,3Е+07
2,0Е+06
<1,0е+06
4,0Е+06
6,9Е+06
1,1Е+08
3,6Е+06
9,0Е+05
1,5Е+07

10°C

3,3Е+07
1,2Е+07
2,6Е+06
3,8Е+08
1,8Е+08
6,8Е+08
6,7Е+08
1,4Е+09
3,8Е+08

15°C

2,5Е+06
8,9Е+07
3,0Е+06
1,3Е+09
5,7Е+08
7,9Е+08
7,3Е+08
1,4Е+09
5,8Е+08

10°C

1,1Е+07
2,8Е+05
2,9Е+07
1,4Е+07
3,6Е+07
7,5Е+06
<1Е+06
<1Е+06
6,5Е+06

15°C

2,5Е+06
2,2Е+06
2,1Е+07
1,0Е+07
1,0Е+07
1,1Е+07
6,0Е+06
2,0Е+06
3,5Е+06


1515