Зберігання цукрових буряків для виробництва біопалива з використанням біоконтрольних мікроорганізмів (частина 2)

 

За матеріалами наукової статті в рамках дослідницької програми MicroDrivE на тему «Зберігання цукрових буряків для виробництва біопалива з використанням біоконтрольних мікроорганізмів» («Storage of sugar beets for biofuel production using biocontrol microorganisms») Кафедри мікробіології Шведського університету сільськогосподарських наук.

Визначення концентрації метану за допомогою газової хроматографії

Для визначення виробленого метану зразок газу аналізували за допомогою газової хроматографії (Perkin Elmer Instruments, Waltham, США). Були використані наступні температури: ін'єкція 60°C; піч 125°C; детектор 250°C. Гелій використовували як газ-носій зі швидкістю потоку 31 мл/хв. Різні концентрації метану включалися як зовнішні стандарти.

Результати та обговорення

Дослідження зберігання

Використання 5·107 клітин/мл біоконтрольних штамів відповідало 3,5·105 КУО/см2 P. fluoresence KJ36 та 5,3·106 КУО/см2 C. oleophila JÄ3 відразу після інокуляції. Дози інфікування шкідливими мікроорганізмами складали 1,3·103 та 2,2·103 КУО/см2 F. culmorum J617 та C. cladosporioides J308, відповідно. Поверхнева стерилізація працювала ефективно, адже жодні організми не розросталися до цілих колоній на цукрових буряках після стерилізації. Однак було виявлено ендогенні бактерії у кількості 550 КУО/г, що відповідає приблизно 5·103 КУО/шматочок цукрового буряка. Ендогенні бактерії — це бактерії, які природним чином існують у рослинній тканині, включаючи корені цукрових буряків.

Втрати маси під час зберігання

Втрати маси з часом зростали і були більшими для зразків, що зберігалися при 15°C, ніж при 10°C (див. Таблицю 2). Інокуляції біоконтрольними та шкідливими організмами, здається, не мали впливу на втрати маси.

Таблиця 2. Втрати маси у відсотках, обчислені як середнє значення з n = 2

Зразок Втрати маси, %
1 місяць 4 місяці
10°С 15°С 10°С 15°С

D
E
F
G
H
I
J
K
L

1,8
2,3
1,9
1,8
2,5
2,0
1,8
2,0
1,7

2,5
3,9
4,0
3,2
3,5
3,2
2,0
4,4
2,8

9,4
11,1
10,6
14,4
12,1
13,5
9,7
12,4
10,4

14,7
14,4
13,5
17,4
16,3
13,9
15,4
15,5
16,9

Середнє значення

t-критерій Стьюдента

2,0

0,3

3,3

0,8

11,5

1,7

15,3

1,3

Клітинне дихання є основною причиною втрати маси цукрових буряків. Під час дихання вуглецеві сполуки в цукрових буряках, насамперед сахароза, окислюються, щоб забезпечити клітинам метаболічну енергію та субстрати. Під час цього процесу виділяється СО2, і цукровий буряк втрачає масу. В умовах обох температурних режимів втрати маси, схоже, збільшуються зі збільшенням тривалості зберігання, відповідно після чотирьох місяців втрати маси буряків виявилися більшими, ніж після одного місяця зберігання.

Мікробний ріст під час зберігання цукрових буряків

Результати визначення кількості життєздатних мікроорганізмів, виконаного через один місяць, представлені в Таблиці 12, а через чотири місяці — в Таблиці 13.

Отримані результати свідчать про те, що кількість ендогенних (внутрішніх) бактерій збільшилася а, отже, біозахисні організми на поверхні цукрових буряків жодним чином на них не впливали. У всіх зразках буряків їх кількість збільшилася з 550 КУО/г до приблизно 106 КУО/г. Зі знімків, зроблених перед відкриттям контейнерів (Рис. 1), можна зробити висновок, що видиме утворення цвілі не відповідає результатам визначення кількості життєздатних мікроорганізмів. Імовірно, це можна пояснити двома факторами: C.oleophila здебільшого гальмує утворення цвілі на шматочках буряків, а також те, скільки спорів утворили гриби на цих же шматочках. Раніше було досліджено декілька грибково-інгібуючих сполук, жодна з яких не гальмував ріст C.oleophila JÄ3. Тому утворення цвілі не можна було достовірно підрахувати.

Звідси виходить, що біозахист не спрацьовує, оскільки біоконтрольні організми не гальмують ріст шкідливих мікроорганізмів. На оброблених зразках (G-L) цвіль утворювалася аналогічно до необроблених зразків (D-F).

Вміст летючих жирних кислот (VFA)

Концентрації летючих жирних кислот у зразках цукрових буряків після зберігання представлені в Таблиці 3. Із цих результатів здається, що зразки, оброблені P. fluorescence KJ36, мають вищий вміст летючих жирних кислот.

Таблиця 3. Концентрації VFA. Представлені значення є середніми значеннями з n = 2, в розрахунках враховуються втрати маси, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків. Зразки, в яких не було виявлено летючих жирних кислот, в таблиці не представлені.

Зразок Летючі жирні кислоти (VFA) Концентрація г VFA/г цукрового буряка

Один місяць

G (15°С) 
I (15°С)

 

Бутират
Бутират

 

0,03
0,04

Чотири місяці

G (10°С)
H (10°С)
I (10°С)

 

Бутират
Бутират і валерат
Бутират

 

0,04
0,04; 0,02
0,06

Загальні (TS) і летючі тверді речовини (VS)

Кількість загальних твердих та летючих твердих речовин після коригування концентрації летючих жирних кислот, визначених аналізом за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії, показано в Таблиці 4.

Зразки цукрових буряків до зберігання мають найвищі значення TS (25%) та VS (23%), а зразки, які зберігалися при 15°C протягом чотирьох місяців, мають найнижчі значення.

Під час зберігання кількість загальних твердих речовин (TS) зменшилася в усіх досліджуваних зразках. Менше значення ТS вказує на більший вміст води, тобто вологіший зразок. Під час дихання вуглецеві сполуки окислюються до СО2 та Н2О, що пояснює зниження значення ТS. Вміст летючих твердих речовин (VS) також зменшився у всіх зразках під час зберігання, ймовірно, через клітинне дихання цукрових буряків та збільшення біоконтрольних та шкідливих мікроорганізмів, які поглинають вуглецеві сполуки, отже це вплинуло і на значення TS. Зменшення значень TS та VS підтверджуються цукровим аналізом, який показав, що загальна кількість цукру зменшилася під час зберігання буряків (Таблиця 3 та 4). Загальний вміст цукру зменшився, порівняно зі зразками буряків до зберігання, та порівняно зі зразками, які зберігалися протягом одного та чотирьох місяців.

Таблиця 4. Загальні (TS) і летючі тверді речовини (VS) для різних зразків і тривалість зберігання як середнє значення при n = 2. Розрахунки були зроблені щодо втрати маси кожного зразка, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків.

Зразок Загальні тверді речовини (TS), % Летючі тверді речовини (VS), %
1 місяць 4 місяці 1 місяць 4 місяці
10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С 10°С 15°С

D
E
F
G
H
I
J
K
L

19,0
17,9
19,0
19,1
18,4
18,3
19,8
17,8
19,7

188,7
17,1
18,8
19,9
16,7
20,8
19,0
15,8
18,7

14,9
11,1
13,7
13,4
17,4
16,2
13,3
7,4
12,5

11,9
8,0
8,8
6,8
7,0
6,7
7,0
6,1
6,8

18,8
17,8
18,7
18,9
18,1
17,9
19,6
17,4
19,5

18,4
16,6
18,7
19,4
16,5
20,3
18,6
15,5
18,4

14,6
10,8
13,4
11,8
15,5
14,3
13,6
7,1
12,2

11,4
7,7
8,4
6,4
6,8
6,5
6,8
5,8
6,4

Середнє значення 18,8 18,4 13,3 7,7 18,5 18,0 12,6 7,3
Цукрові буряки до зберігання 21,4 21,1

Температура та тривалість зберігання мали великий вплив на значення TS та VS. Більш органічний матеріал використовується при вищій температурі та довшій тривалості зберігання.

Вміст цукру

Зразки, які зберігалися протягом одного місяця

Графік 3. Вміст цукру після одного місяця зберігання. Представлені значення є середнім значенням з n = 2, при розрахунках враховано втрату маси, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків.

Загальний вміст цукру зменшився у всіх зразках, порівняно з буряками до зберігання (Графік 3). Зразок цукрових буряків до зберігання містив, в основному, сахарозу. В інокульованих зразках кількість глюкози та фруктози збільшилася, що вказує на те, що сахароза перетворилася на глюкозу та фруктозу. У зразках, інокульованих F. culmorum J617 (E, H та K), було перетворено більше сахарози, порівняно з іншими інокуляціями. Схоже, що C. cladosporioides J308 не має настільки сильного впливу на перетворення сахарози в глюкозу та фруктозу в інокульованих зразках. Це перетворення є основною причиною того, чому цукрові буряки, які використовуються для виробництва цукру, не можуть довго зберігатися, але для виробництва біоенергетики перетворення в моносахариди, мабуть, є меншою проблемою.

Зразки, які зберігалися протягом чотирьох місяців

У всіх зразках, які зберігалися протягом чотирьох місяців, вміст цукру виявився значно меншим, порівняно з одним місяцем зберігання (Графіки 3 та 4). Дихання та розвиток шкідливих мікроорганізмів зменшили загальну кількість цукру. Тільки зразки, неінокульовані біоконтрольними організмами (D-F), містили помітну кількість цукру після зберігання при 15°С. Зразок D, абсолютно неінокульований, виявився єдиним серед усіх зразків, які зберігалися при 15°C, що мав найбільшу кількість цукру. Тому, можна припустити, що біоконтрольні та шкідливі мікроорганізми зменшують загальну кількість цукру в буряках. Біоконтрольні організми не мали ніякого захисного впливу проти скорочення вмісту цукру або перетворення сахарози в глюкозу та фруктозу. Однак, не можна виключити й те, що сахароза також могла перетворитися на інші цукри, крім глюкози та фруктози, адже під час зберігання сахароза може перетворюватися, наприклад, у рафінозу.

Графік 4. Вміст цукру після чотирьох місяця зберігання. Представлені значення є середнім значенням з n = 2, при розрахунках враховано втрату маси, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків.

Виробництво етанолу

Вихід етанолу

Вихід етанолу з 1 г сухої речовини показано в Таблиці 5. У всіх ферментаціях використовувався один і той же зразок цукрових буряків до зберігання. Однак вихід етанолу з 1 г сухої речовини був нижчим у першій ферментації (10°С, один місяць), порівняно з іншими ферментаціями (Таблиця 5). Причина цього невідома, а отже, вихід етанолу представлений у відсотках від зразка цукрових буряків до зберігання у всіх ферментаціях, щоб можна було порівнювати різні способи інокуляцій (Графік 5).

Вихід етанолу з 1 г сухої речовини дає більше інформації про те, скільки біоетанолу можна отримати після різних інокуляцій цукрових буряків.

Таблиця 5. Вихід етанолу (1 г етанолу на 1 г сухої речовини) для різних зразків та різної тривалості зберігання. Вихід етанолу представлено як середнє значення з n = 2. Втрати маси враховувались у розрахунках, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків.

Зразок Вихід етанолу (1 г етанолу на 1 г сухої речовини)
1 місяць 4 місяці
10°С 15°С 10°С 15°С
D
E
F
G
H
I
J
K
L
0,27
0,27
0,27
0,24
0,25
0,25
0,27
0,26
0,26
0,31
0,27
0,29
0,20
0,28
0,22
0,30
0,25
0,30
0,23
0,15
0,19
0,02
0,05
0,04
0,19
0,00
0,19
0,08
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Середнє значення 0,26 0,27 0,12 0,01
Цукрові буряки до зберігання 0,28 0,35 0,34 0,32

Порівнюючи вихід етанолу з 1 г сухої речовини, не було виявлено значної різниці між різними інокуляціями після одного місяця зберігання (Графік 5). Як правило, вихід етанолу був більший в зразках, які зберігалися при 10°C, порівняно з тими, що зберігалися при 15°C. Але було виявлено помітну різницю між зразками, які зберігалися один і чотири місяці (Графік 5). Після чотирьох місяців зберігання зразки, інокульовані P. fluoresence KJ36, (G-H), мають найменший вихід етанолу при обох температурних режимах. Вихід етанолу, отриманий зі зразків, інокульованих біоконтрольним організмом C. oleophila JÄ3 (J-L), не був нижчим, ніж в неінокульованих зразках (D-F), а також у зразках, що зберігалися при 10°C, за винятком зразка K, інокульованого F. culmorum J617. У всіх інокульованих зразках (E-L), які зберігалися при 15°C протягом 4 місяців, не спостерігалося виділення етанолу. Це відповідало цукровому аналізу (Графік 4), де у відповідних зразках майже не містилося цукру, відповідно був відсутній субстрат, із якого ферментаційні дріжджі могли б виробляти етанол.

Можна зробити висновок, що протягом одного місяця зберігання цукрових буряків температурний режим мав незначний вплив. Жодна інокуляція не виявилася ефективнішою за неінокульовані зразки. Біоконтрольні організми досить сильно зменшили вихід етанолу у вигляді скорочення вмісту цукру, що викликало скорочення виходу етанолу в зразках, що зберігалися протягом чотирьох місяців.

Графік 5. Вихід етанолу (1 г етанолу на 1 г сухої речовини) представлений у відсотках від зразка цукрових буряків до зберігання. Вихід етанолу розраховується як середнє значення з n = 2, а втрата маси враховується при розрахунках, тобто результати ґрунтуються на початковій масі цукрових буряків.

Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів

Один місяць зберігання при 10°С

Таблиця 6. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів для ферментації зразків, які зберігалися при 10°С та протягом 1 місяця, через 42 год.

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі, стійкі до циклогексиміду* S. cerevisiae
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Цукрові буряки до зберігання

<10
<10
<10
1,0Е+07
<10
<10
<10
<10
<10
<10

<10
7,0Е+01
<10
<10
<10
7,5Е+01
8,2Е+04
2,2Е+04
8,8Е+04
<10

3,6Е+07
3,5Е+07
2,8Е+07
2,9Е+07
3,6Е+07
3,6Е+07
2,7Е+07
3,8Е+07
2,1Е+07
2,6Е+07

*Дріжджі, стійкі до циклогексиміду, були проаналізовані, щоб дослідити, чи впливає біоконтрольний організм C. oleophila JÄ3 на процес ферментації.

Кількість бактерій та дріжджів у зразках ферментації представлено в Таблиці 6. Загалом кількість бактерій у ферментації зразків, які зберігалися протягом одного місяця при 10°С, була дуже низькою. Лише один зразок (G), інокульований P. fluoresence KJ36, але без шкідливих мікроорганізмів, містив велику кількість бактерій 1,0·107 на мл. Таким чином, ендогенні бактерії, виявлені після зберігання, не є проблемою під час ферментації. Зразки з швидким ростом дріжджів, стійких до циклогексиміду, виявилися зразками з C. oleophila JÄ3, доданим у якості біоконтрольного організму. Ріст S. cerevisiae J672 був більш-менш однаковим для всіх зразків: 2,1-3,8·107 КУО/мл — для зразків на зберіганні та найвищий — 4,6·107 КУО/мл — для зразка буряків до зберігання. Первинний інокулюм на початку ферментації складав 2,2·107 КУО/мл.

Один місяць зберігання при 15°С

Кількість бактерій та дріжджів у зразках ферментації представлено в Таблиці 7. Ці зразки зберігалися при вищій температурі і ріст бактерій був інтенсивнішим, ніж у зразках, які зберігалися при 10°С. Зразок цукрових буряків до зберігання також показав ріст бактерій після ферментації, тому не можна виключати те, що виявлений ріст бактерій є результатом зараження. У зразках D та H було виявлено дріжджі, стійкі до циклогексиміду, навіть при тому, що вони не були інокульовані C. oleophila JÄ3. Тобто, можна зробити припущення, що C. oleophila природним чином утворилася в цукрових буряках або деяких інших стійких до циклогексиміду дріжджах. Також у цій ферментації ріст S. cerevisiae J672 був однаковим для всіх зразків, що дозволяє припустити, що бактеріологічне зараження не впливало на ріст ферментаційних дріжджів. Первинний інокулюм на початку ферментації складав 2,7·107 КУО/мл.

Таблиця 7. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів для ферментації зразків, які зберігалися при 15°С та протягом 1 місяця, через 42 год.

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі, стійкі до циклогексиміду* S. cerevisiae
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Цукрові буряки до зберігання

<10
2,0Е+07
5,4Е+06
2,5Е+05
1,5Е+05
1,0Е+05
<10
<10
<10
5,1Е+06

1,1Е+02
<10
<10
<10
1,1Е+03
<10
1,9Е+05
2,5Е+02
5,5Е+04
3,4Е+02
5,8Е+07
5,8Е+07
6,8Е+07
4,8Е+07
4,8Е+07
5,0Е+07
6,5Е+07
5,1Е+07
5,1Е+07
6,1Е+07

Чотири місяці зберігання при 10°С

Кількість бактерій та дріжджів у зразках, які зберігалися протягом чотирьох місяців при 10°С, представлено в Таблиці 8. На відміну від ферментації зразків, які зберігалися протягом одного місяця, у зразках, які зберігалися чотири місяці, було виявлено велику кількість грибкової цвілі. Тобто, цвіль витримала як заморожування, так і ферментацію. Кількість стійких до циклогексиміду дріжджів також виявилася дещо більшою (Таблиця 8), що свідчить про більшу кількість C. oleophila JÄ3 або деяких інших стійких до циклогексиміду дріжджів, які природним чином зустрічаються в цукрових буряках. Первинний інокулюм на початку ферментації складав 2,2·107 КУО/мл. Ріст S. cerevisiae J672 також був аналогічним до попередніх ферментацій.

Таблиця 8. Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів для ферментації зразків, які зберігалися при 10°С та протягом 4 місяців, через 42 год.

Зразок КУО/мл
Бактерії Дріжджі, стійкі до циклогексиміду* S. cerevisiae
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Цукрові буряки до зберігання

5,0Е+05
<10
1,0Е+01
1,0Е+05
4,1Е+06
<10
<10
6,9Е+08
3,5Е+05
<10

9,9Е+02
2,7Е+03
<10
9,5Е+05
2,5Е+01
6,4Е+05
4,4Е+05
5,3Е+06
2,3Е+06
<10

5,3Е+07
2,1Е+07
1,4Е+07
1,4Е+07
1,2Е+07
2,3Е+07
5,4Е+07
4,2Е+07
4,1Е+07
8,3Е+07


1546