За матеріалами наукової статті в рамках дослідницької програми MicroDrivE на тему «Зберігання цукрових буряків для виробництва біопалива з використанням біоконтрольних мікроорганізмів» («Storage of sugar beets for biofuel production using biocontrol microorganisms») Кафедри мікробіології Шведського університету сільськогосподарських наук.

Біогаз та біоетанол — відновлювальні джерела енергії, які є перспективними альтернативними видами палива. Біогаз виробляється в процесі анаеробного дигерування з широкого спектру органічних матеріалів, у той час як біоетанол виробляється, в основному, з різних цукроносних та зернових культур за допомогою процесу ферментації.

Біозахисні організми — флуоресцентна псевдомонада (Pseudomonas fluoresence KJ36) та кандида олеофіла (Candida oleophila JÄ3) — були виділені з цукрових буряків та показали здатність інгібувати різні грибкові збудники в агаровому середовищі. Сподіваючись продовжити термін зберігання цукрових буряків, було проведено дослідження їх зберігання з використанням біоконтрольних організмів Candida oleophila JÄ3 та Pseudomonas fluoresence KJ36. Елементарні обсяги цукрових буряків зберігалися при температурі 10°C та 15°C протягом одного та чотирьох місяців. Мікробний ріст під час зберігання цукрових буряків вимірювався за рахунок визначення кількості життєздатних мікроорганізмів, а потім аналізувався вплив біоконтрольних організмів на виробництво біогазу та етанолу за допомогою експериментів з анаеробним дигеруванням та ферментацією. Для визначення впливу біоконтрольних мікроорганізмів на вміст цукру в буряках під час їх зберігання було проаналізовано концентрації сахарози, глюкози та фруктози за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з пульсуючим амперометричним детектором.

Загальновизнаним фактором, який є основною причиною глобального потепління, є прискорене вивільнення вуглекислого газу СО₂ внаслідок людської діяльності. Занепокоєння щодо того, що світові запаси сирої нафти закінчуються, у поєднанні з екологічним фактором покладають надію на біомасу та біоенергію. Біогаз та біоетанол є відновлювальними джерелами енергії та розглядаються як перспективні альтернативні види палива.

Цукрові буряки мають високий вміст конвертованих вуглеводів, що робить їх придатними для виробництва відновлювальної енергії, єдиною проблемою є короткий період їх зберігання. Щоб мати можливість використовувати цукрові буряки протягом більш тривалого періоду в сезоні, необхідно збільшити тривалість їх зберігання. Біологічний контроль, використання мікроорганізмів для захисту зібраних коренеплодів від патогенів можуть бути одним із способів продовження тривалості зберігання буряків.

Біогаз

Біогаз — це поєднання метану (55-75 об. %) та вуглекислого газу (25-45 об. %), є кінцевим продуктом анаеробного дигерування, коли органічний матеріал розкладається без участі кисню. У природі біогаз утворюється в анаеробних екосистемах, таких як рубець, осади, рисові поля та залиті водою ґрунти, де анаеробне дигерування відбувається природним чином.

Біогаз можна виробляти з широкого спектру органічних матеріалів: гною, енергетичних культур, залишків сільськогосподарських культур, міських та промислових органічних відходів. Біогаз є відновлювальним паливом і може використовуватися в різних енергетичних цілях, таких як автомобільне паливо, теплоенергія або комбінована теплоенергія та електроенергія. Недоліком є те, що біогаз — це газоподібне паливо в нормальних умовах (температура та тиск), що ускладнює його розподіл та зберігання, на відміну від рідкого палива.

Залишок анаеробного дигерування — дигестат — можна використовувати в якості добрива в сільському господарстві. Біогенні елементи є нерозкладними речовинами і тому залишаються в біогазовому залишку. Ефективність таких добрив збільшується, оскільки процес дигерування збільшує вміст азоту в дигерованій речовині, порівняно з недигерованою. Іншою екологічною перевагою використання залишків біогазу в якості добрив є зменшення використання добрив на основі мінеральних речовин, виробництво яких вимагає великих витрат енергії.

Процес отримання біогазу

Виробництво біогазу можна розділити на чотири етапи, які залежать від різних груп мікроорганізмів. Перший етап — гідроліз, при якому органічні полімери розщеплюються на мономери або димери, які можуть пропускати клітинну мембрану. Біологічна деструкція органічних полімерів — це ферментативний процес, який здійснюється екзоферментами, що виділяються кислотоутворюючими бактеріями. Кислотогенез — наступний етап виробництва біогазу, під час якого розчинена органічна речовина біорозпадається до летючих жирних кислот, спиртів та вуглекислого газу за допомогою кислотоутворюючих бактерій. Потім летючі жирні кислоти та спирти перетворюються в ацетат або водень та вуглекислий газ за допомогою ацетогенних бактерій під час так званого процесу ацетогенезу. Останній етап виробництва біогазу — метаногенез, при якому дві групи метаноутворюючих бактерій виділяють метан відповідно з ацетату або водню та вуглекислого газу. Метаногенез — найбільш чутливий до рівня рН етап анаеробного дигерування і відбувається лише за умови нейтрального рН (6,5 -7,5). Перші три етапи виробництва біогазу можуть проходити при широкому діапазоні значень pH. Усі етапи виробництва біогазу повинні залишатися нерозривним, безперервним процесом, щоб забезпечити стабільне дигерування та запобігти накопичення проміжних речовин.

Анаеробне дигерування поділяється на три види залежно від того, при якій температурі цей процес відбувається: психрофільне (10-20°С), мезофільне (20-40°С) та термофільне (50-60°С) дигерування. Вища температура збільшує ріст бактерій та прискорює дигерування органічного матеріалу, підтримуючи високу швидкість навантаження. Тому психрофільне дигерування викликає тривалі затримки, а отже, не широко розповсюджене. Але, цей процес більш чутливий при термофільних умовах через швидше інгібування амонію.

Біоетанол

Етанол можна отримати або синтетичним шляхом, або за допомогою процесу ферментації. Біоетанол — це етанол, який отримують шляхом ферментації сировини галузі сільського господарства та лісової промисловості. Сьогодні виробництво біоетанолу є найбільшим промисловим мікробіологічним процесом. Біоетанол виробляється в основному з крохмальної сировини та цукру за допомогою періодичної ферментації із застосуванням дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Із загального обсягу світового виробництва біоетанолу 57% припадає на цукроносні культури, 42% — на зернові та 1% — на відходи лісової промисловості.

Етанол може використовуватися як паливо, оскільки він є як відновлювальним, так і екологічно чистим паливом, як одна з найкращих альтернатив викопних видів палива. Перевага біоетанолу, порівняно з біогазом, полягає в тому, що він переходить у рідкий стан при атмосферному тиску. Тому його легше розподіляти, зберігати та використовувати як паливо, на відміну від біогазу, який потребує нової розподільної інфраструктури. Недоліками біоетанолу є його корозійність, низький тиск насиченої пари, що ускладнює холодний запуск двигуна, і менша питома енергія, порівняно з бензином (біоетанол має 66% енергії, яку має бензин). Однією з основних проблем виробництва біоетанолу є вибір сировини. Доступність сировини змінюється від сезону до сезону і залежить від географічного розположення. Ціна на сировину також є дуже мінливою, тому сильно впливає на собівартість біоетанолу.

Ферментація етанолу

Гліколіз, який також називають шляхом Ембдена-Меєргофа-Парнаса, є основним метаболічним шляхом, що використовується під час ферментації етанолу. У процесі гліколізу одна молекула глюкози перетворюється на дві молекули пірувату. Потім в анаеробних умовах піруват відновлюється до етанолу та вуглекислого газу. З одного моля глюкози отримують два молі діоксиду вуглецю і два молі етанолу:

C₆H₁₂O₆ → 2 CO₂ + 2 C₂H₅OH

Температура ферментації може бути як мезофільною (25-37°C), так і термофільною (45-55°C). Найпоширенішою є мезофільна ферментація. Однак термофільний процес є більш продуктивним, але й більш чутливим, тому його дослідження та розробки все ще продовжуються.

Виробництво етанолу тісно пов'язане з ростом дріжджової клітини. У процесі гліколізу утворюються два АТФ (аденозинтрифосфати), які використовуються як рушійна сила для біосинтезу дріжджових клітин. Якщо АТФ не поглинаються за рахунок росту дріжджових клітин, відбувається їх внутрішньоклітинне накопичення, яке починає гальмувати процес гліколізу, відповідно виробництво етанолу припиняється. У дріжджових клітинах, які не ростуть, швидкість ферментації етанолу в 30 разів повільніша, ніж у дріжджах, які ростуть.

Цукрові буряки

Цукровий буряк, Beta vulgaris, разом із цукровою тростиною є основними видами сировини для виробництва цукру (сахарози). Цукрову тростину можна вирощувати лише в тропічних та субтропічних регіонах, тоді як цукровий буряк вирощується майже в усьому світі, але переважно в помірних широтах.

Цукрові буряки вирощуються з насіння, і перший період росту рослин — це період формування листового апарату. Протягом перших шести тижнів після посіву корінь росте дуже повільно, але за цей період у рослини розвиваються перші 8-10 листочків. Із цього етапу корінь починає рости одночасно з листками і стає більшою частиною загальної сухої маси рослини. Цукрові буряки зазвичай висівають у квітні, а збирають восени, починаючи з жовтня місяця.

Виробництво цукрових буряків є капіталомістким і трудомістким завданням через потреби в часі, знаннях та спеціальній техніці для фермерів. Під час збирання транспортування та кагатування цукрових буряків неминучі без втрат. Поверхневі пошкодження кореня, порізи та тріщини його поверхні — це характерні травми цукрових буряків. Різні пошкодження викликають поділ клітин, дихання та виробництво різних сполук для відновлення пошкодженої тканини, ущільнення «ран» та захисту від умовно-патогенних мікроорганізмів. Все це здійснюється за рахунок сахарози, тобто зменшується цукристість травмованих буряків.

Цукрові буряки мають високий вміст конвертованих вуглеводів, що робить їх придатними для виробництва відновлювальної енергії. Щоб мати можливість використовувати їх у біоенергетиці, буряки необхідно ефективно зберігати з мінімальними втратами цукру протягом усього сезону. Біологічний контроль може стати вирішенням проблеми їх довготривалого зберігання.

Біологічний контроль

Сьогодні однією з основних причин втрат врожаю як фруктів, так і овочів, під час їх транспортування та зберігання є хвороби зберігання. Приблизно 20-25% зібраних фруктів та овочів можуть уражатися різними збудниками гнилей після завершення їх збирання. Основним методом боротьби з цими хворобами вважалася обробка синтетичними фунгіцидами. Фунгіциди вбивають або пригнічують розвиток грибків, а в деяких випадках також можуть контролювати ріст бактерій. Однак, підвищена стурбованість щодо токсичності фунгіцидів та стійкості патогенів до них, стимулювала пошуки більш екологічної та безпечної альтернативи для зменшення розвитку гнилей під час зберігання зібраного врожаю.

Біологічний контроль мікробними антагоністами розглядається як перспективна альтернатива методу фунгіцидних обробок. Мікробні антагоністи можуть використовуватися двома способами: для боротьби з хворобами зберігання, або використовувати вже наявні мікроорганізми на фруктах та овочах чи вводити нові. Біоконтрольна активність мікробних антагоністів є складним процесом, механізми якого ще не повністю зрозумілі та досліджені. Повне їх розуміння допоможе відібрати найбільш ефективних антагоністів. Мікробні антагоністи повинні бути ефективнішими для пристосування до різних умов навколишнього середовища та живильних речовин, ніж патогени, щоб мати можливість успішно з ними боротися.

Біоконтрольні організми можна застосовувати до або після збирання врожаю фруктів та овочів. Розвиток гнилей після збирання часто є наслідком прихованих інфекцій від збудників хвороб, які інфікували фрукти чи овочі ще на полі. Мета застосування мікробного агента перед збиранням — колонізувати поверхню коренеплоду для того, щоб пошкодження кореня, заподіяні під час самого процесу збирання, були контрольовані антагоністом, а не збудниками хвороб. Однак це досить важко реалізувати на практиці через низьку життєздатність мікробного агента в польових умовах. Тому, застосування мікробного агента після збирання врожаю є більш ефективним і вважається кращим, більш практичним і корисним способом боротьби з хворобами зберігання врожаю. У цьому методі біоконтрольні організми застосовуються у вигляді розпилювання або способом занурення в розчин після завершення збирання.

Candida oleophila

Candida oleophila — це дріжджі, які проявили здатність пригнічувати розвиток синьої, зеленої та сірої цвілі. Candida oleophila Montrocher (штам 182) — це мікробний агент в біоконтрольному продукті Aspire виробництва компанії Ecogen Inc., США. Aspire була зареєстрована для використання на яблуках, грушах та цитрусових після збирання врожаю, але згодом її було вилучено з обігу.

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas fluorescence — грамнегативна бактерія, яка може пригнічувати як грибкові, так і бактеріальні патогени. Штам A506 — це мікробний пестицид, зареєстрований під назвою Blight Ban A 506 виробництва компанії Nu Farm Inc., США. Його можна використовувати для боротьби з червоною бактеріальною гниллю коренів (хвороба, що руйнує різні тканини дерева та викликає м’які гнилі плодів яблуні, груші, полуниці та картоплі). У дослідженнях також показано, що Pseudomonas fluorescence захищає цукрові буряки від грибка Pythium ultimum, який викликає ризоктоніоз у фазі сходів рослин. Ризоктоніоз, який також називають чорною ніжкою, — це термін, що описує знищення сходів цукрових буряків, викликане інфекціями різних грибів.

Мета

Метою дослідження було з’ясувати, чи можливо подовжити термін зберігання цукрових буряків, використовуючи біоконтрольні організми Candida oleophila JÄ3 або Pseudomonas fluoresence KJ36.

Було досліджено вплив біоконтрольних організмів на вміст цукру, ріст шкідливих мікроорганізмів, вихід біогазу та виробництво етанолу.

Масштабна модель зберігання, використана в цьому дослідженні, була розроблена до початку реалізації цього проекту. У проекті було проведено аналізи для визначення впливу біоконтрольних організмів.

Матеріали та методи

Дослідження зберігання цукрових буряків було проведено з використанням двох видів біоконтрольних організмів — Candida oleophila JÄ3 та Pseudomonas fluoresence KJ36. Біозахисні організми Pseudomonas fluoresence KJ36 та Candida oleophila JÄ3 були виділені з цукрових буряків і показали свою здатність пригнічувати розвиток різних грибкових збудників в агаровому середовищі. Цукрові буряки також були інокульовані двома різними шкідливими мікроорганізмами — Fusarium culmorum J617 та Cladosporium cladosporioides J308 — та вирощувалися при 10°C та 15°C протягом одного та чотирьох місяців. Ріст мікроорганізмів під час зберігання зібраних буряків визначався за допомогою визначення кількості життєздатних мікроорганізмів. Потім було проаналізовано вплив біоконтрольних організмів на виробництво біогазу та етанолу шляхом проведення експериментів з анаеробним дигеруванням та ферментацією. Після чого було проаналізовано вплив біоконтрольних організмів на вміст цукру в буряках під час їх зберігання, вміст сахарози, глюкози та фруктози було визначено за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з пульсуючим амперометричним детектором.

Матеріал

Цукрові буряки

Постачальником цукрових буряків, використаних у дослідженні, стала компанія Syngenta Seed AB, м. Ландскруна, Швеція. Після збирання буряки зберігалися при температурі +4°C та були використані протягом одного тижня.

Біогазовий інокулят

Залишки біогазу, використані в дослідженні, постачалися з біогазового заводу в м. Вестерос. Біогазовий завод працює на органічних побутових відходах, осадах жирових сепараторів та силосованих пластових культурах, переробляючи їх при мезофільній температурі.

Інокули, залишки біогазу, мали вміст летючих твердих речовин (VS) 2,2-2,7% та витримувалися протягом 1-2 тижнів до початку дослідження, щоб зменшити фонове виробництво біогазу з залишкового органічного матеріалу. Цей залишок також фільтрувався для видалення всіх неперероблених залишків силосу зі злакових для отримання більш однорідного інокуляту.

Мікроорганізми та середовище їх росту

Використані в дослідженні мікроорганізми:

• біоконтрольні організми: Candida oleophila JÄ3 та Pseudomonas fluoresence KJ36;
• шкідливі оорганізми: Fusarium culmorum J617 та Cladosporium cladosporioides J308;

• ферментативні дріжджі: Saccharomyces cerevisiae J672.

Бактерії вирощувалися в живильному середовищі TSA/D (триптичний соєвий агар (OXOID LTD, м. Бесінгсток, Англія)), що містив 0,1 г/л дельвоциду (Gist-brocades, м. Делфт, Нідерланди) для запобігання росту грибів). S. cerevisiae J672 вирощувалися в живильному середовищі MEA/C (солодово-пептонний агар (OXOID LTD, м. Бесінгсток, Англія)), що містив 0,1 г/л хлорамфеніколу (Boehringer Mannheim GmbH, м. Мангейм, Німеччина) та 0,1 г/л стрептоміцину (Duchefa Biochemical, м. Гарлем, Нідерланди) для запобігання росту бактерій). S. cerevisiae J672 вирощувалися в середовищі YPD (дріжджового екстракту пептон декстрози) (40 г/л D-глюкози (Duchefa Biochemical, м. Гарлем, Нідерланди), 10 г/л пептону (OXOID LTD, м. Бесінгсток, Англія), 5 г/л дріжджового екстракту (OXOID LTD, м. Бесінгсток, Англія). S. cerevisiae J672 вирощувалися в живильному середовищі YPD/C (такий же склад, як і в середовища YPD, але з агаром 12 г/л (OXOID LTD, м. Бесінгсток, Англія) та хлорамфеніколом 0,1 г/л для запобігання росту бактерій). C. oleophila JÄ3 вирощувався в середовищі YPD/C /Cyc (такий же склад, як в YPD/C, але з додаванням 10 мкг/л циклогексиміду (Sigma Chemical CO, м. Сент-Луїс, США) для запобігання росту S. cerevisiae J672). Їх витримка проводилася при 25°C, якщо для цього не передбачалися інші умови.

Методи

Масштабна модель зберігання цукрових буряків, використана в даному дослідженні, була розроблена до початку реалізації проекту. 

Дослідження процесу зберігання

Цукрові буряки різали на дрібні шматочки розміром 2х2х2 см, які поверхнево стерилізувалися 1,5% гіпохлоритом натрію, NaClO, ретельно промивалися в дистильованій воді та висушувалися стерильним повітрям. Після цього їх інокулювали 5·10⁷ клітин/мл (пептонної води) біоконтрольними організмами (C. oleophila JÄ3 або P. fluoresence KJ36) у пептонній воді або обробляли пептонною водою. Після висушування стерильним повітрям кожен зразок розділили ще на три зразки, які оброблялися пептонною водою, 10⁵ спор/мл (пептонної води) шкідливих мікроорганізмів Fusarium culmorum J617 та Cladosporium cladosporioides J308 (див. Графік 2 схеми інокуляції). Після інокуляції зразки висушувалися стерильним повітрям і розділялися на вісім порцій приблизно по 100 г (по 11 шматочків) у полістирольні контейнери (Рис. 1), які закривали кришками з газопропускним фільтром, що забезпечував 13 газообмінів за добу (COMBINESSnv, м. Еке, Бельгія). Була визначена точна маса кожного зразка. Із кожного зразка відбирали по чотири контейнери, які витримували при 10°С та 15°С протягом одного та чотирьох місяців. Необроблені шматочки буряків подрібнювали міксером та заморожували для подальшого використання в якості контрольних зразків (так званих «цукрових буряків до зберігання»). Визначалася кількість ендогенних бактерій.

Для того, щоб переконатися в успішності поверхневої стерилізації, 8 шматочків, відібраних за принципом випадковості, витримували в середовищі MEA/C та TSA/D.

Графік 2. Схема інокуляції, або яким чином різні зразки були інокульовані в різних комбінаціях. Pw — пептонна вода, Fc — Fusarium culmorum J617 і Cc — Cladosporium cladosporioides J308

Кожна група складається з двох зразків, і кожен результат, представлений у даному дослідженні, є середнім арифметичним кожних двох зразків.

Завершення досліджень зберігання

Через один та чотири місяці було відкрито два контейнери з кожної групи, а бурякові кубики зважили для визначення втрат у вазі під час їх зберігання. Потім їх подрібнювалися в міксері. 10 г цієї суміші змішували з 90 мл пептонної води, витримували протягом 2 хв в гомогенізаторі Stomacher за нормальної швидкості, а загальна кількість бактерій, цвілі та дріжджів визначалася за допомогою визначення кількості життєздатних мікроорганізмів. Залишковий матеріал заморожували при -20°С для проведення подальших аналізів.

Аналізи

Загальні і летючі тверді речовини

Щоб можна було правильно завантажувати партії біогазу, тобто не перевантажувати систему, визначався вміст органічної речовини різних зразків цукрових буряків. Кількість загальних твердих речовин (TS) або сухої речовини (DM) аналізували за допомогою висушування зразків при 105°С протягом ночі. Вміст неорганічної та органічної речовини в зразку можна було обчислити шляхом зважування зразка до та після сушки сухої речовини. Вміст органічної речовини в зразку можна було виміряти після визначення вмісту загальних твердих речовин (TS) та летючих твердих речовин (VS). Зразок витримували при температурі 550°С протягом ночі. Спочатку піч нагрівали до 300°С та витримували протягом однієї години, щоб запобігти занадто сильному підігріву зразків, що могло б викликати його згорання та перехресну контамінацію. Протягом решти часу температура досягала 550°C. За допомогою зважування золи, яка залишилася після процесу горіння, та віднімання її маси від маси до горіння було обчислено вміст летючих твердих речовин (VS).

Вилучення летючих жирних кислот та цукрів

Для визначення концентрації летючих жирних кислот (VFA) і цукрів у зразках проводився процес екстракції (вилучення). Приблизно 5 г подрібнених цукрових буряків зважували в гомогенізованому мішку. Деіонізовану воду додавали в десять разів більше маси буряків перед тим, як суспензію перемішували в гомогенізаторі протягом 120 с при стандартній швидкості. Приблизно 10 мл отриманої суспензії заливали в 15 мл пробірку та заморожували. Потім зразки стерильно фільтрували з розміром пор 0,45 мкм (Sarstedt, м. Нюмбрехт, Німеччина) перед проведенням аналізу методом високоефективної рідинної хроматографії летючих жирних кислот та високоефективної аніонообмінної хроматографії цукру з пульсуючим амперометричним детектором.

Визначення летючих жирних кислот за допомогою рідкої хроматографії високого тиску

Висока концентрація летючих жирних кислот (VFA) у зразках може впливати на результат визначення загальних та летючих твердих речовин. Значення TS і VS будуть занадто низькими, так як VFA не піддаються вимірюванню, оскільки вони випаровуються під час нагрівання. Тому концентрації VFA визначалися за допомогою рідкої хроматографії високого тиску для отримання точних значень TS та VS з визначення летючих твердих речовин.

Екстраговані зразки стерильно фільтрували з розміром пор 0,45 мкм. Аналіз виконувався за допомогою системи рідкої хроматографії високого тиску Aglient 1100 (Agilent Technologies, м. Стокгольм, Швеція) з рефрактометричним детектором при 40 бар та 60°С. Рухома фаза становила 5 ммоль H₂SO₄ з потоком 0,6 мл/хв.

Суміші глюкози, лактату, ацетату, пропіонату, I-бутирату, бутирату, I-валерату, I-капронату та капронату в концентраціях 0,250 г/л, 0,5 г/л, 1 г/л та 2 г/л додавалися в стандартні розчини.

Визначення вмісту цукру за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії з пульсуючим амперометричним детектором

Вміст цукру в буряках визначався за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії за допомогою системи імпульсного амперометричного детектування ICS3000 (Dionex, м. Саннівейл, США). Для контролю та аналізу даних було використано програму Chromelion 6.80 (Dionex, м. Саннівейл, США).

Для стандартних розчинів використовували суміші різної концентрації глюкози, сахарози та фруктози. Використовувані елюенти складали 100% води та 0,2 моль NaOH з потоком 1 мл/хв.

Потенціал виробництва етанолу

Потенціал виробництва етанолу з цукрових буряків було визначено шляхом проведення досліджень процесу ферментації. S. cerevisiae J672 вирощувалися в середовищі пептон декстрози дріжджів при перемішуванні (130 об./хв) при 30°С. Приблизно 2,5 г подрібненого буряка додавали до 50 мл тестмедію, основи азотного агару для дріжджів (Difco Laboratories Inc., м. Детройт, США), в 80 мл пляшку. У кожну пляшку додавали по одному мілілітру S. Cerevisiae.

Пляшки герметично закривали гумовою пробкою, оснащеною шприцом, через який виходив виділений газ і тим самим контролювався рівень тиску. Потім їх витримували, перемішуючи (130 об./хв) при 30°С.

Через 24 год і 42 год (коли закінчилася ферментація) відбиралися зразки для проведення аналізу методом високоефективної рідинної хроматографії для визначення кількості виділеного етанолу. Зразки стерильно фільтрували з розміром пор 0,45 мкм (Sarstedt, м. Нюмбрехт, Німеччина). Аналіз проводили за системою Agilent 1100 (Agilent Technologies, м. Стокгольм, Швеція) з рефрактометричним детектором при 40 бар і 60°C. Рухома фаза склала 5 ммоль H₂SO₄ з потоком 0,6 мл/хв.

Із зразків, які витримувалися 42 год., кількість дріжджів та бактерій аналізували за допомогою визначення кількості життєздатних мікроорганізмів у середовищі пептон декстрози дріжджів та триптичного соєвого агару при 25 °С протягом 48 год. Один зразок пептон декстрози дріжджів також містив циклогексимід для запобігання росту S. cerevisiae J672, і таким чином можна було підрахувати колонії біоконтрольних дріжджів C. oleophila JÄ3 та будь-яких інших дріжджів, стійких до циклогексиміду.

Геномна ідентифікація

Для перевірки росту  дріжджів C. oleophila JÄ3 у середовищі пептон декстрози дріжджів із додаванням дельвоциду застосовували методику геномної ідентифікації. Колонії дріжджів поміщали в підвішеному стані у стерилізовану деіонізовану воду та кип'ятили протягом 2-3 хв для руйнування клітин. Потім зразки центрифугували при 8 000 г за 2 хв, щоб видалити залишки клітин. 1 мкл супернатанту змішували з 9 мкл преміксу, розчинених у 80 мкл стерилізованої деіонізованої води. Аналіз полімеразної ланцюгової реакції виконувався за допомогою програми MiniCycler (MJ Research, Waltham, США), показаною в Таблиці 1.

Таблиця 1. Програма полімеразної ланцюгової реакції

Потенціал виробництва газу

Потенціал виробництва газу для різних зразків цукрових буряків визначався за допомогою досліджень партії біогазу. Реактори були 309 мл скляними контейнерами. Швидкість органічного завантаження (OLR) складала 9 г VS/л. Для забезпечення стабільного процесу використовувалося співвідношення 2:1 інокуляту до субстрату. Подрібнені цукрові буряки додавали в такій кількості, щоб швидкість органічного навантаження зразка з найвищим вмістом VS складала 3 г VS/л (~2,6-3,5 г) для уникнення перевантаження системи. Інокулят (~42-52 г) переносили в колби під час промивання змішаним газом азоту та вуглекислого газу для зменшення впливу кисню. Для отримання загального, робочого об'єму 190 мл додавалася вода. Для визначення виробництва метану з інокуляту було проведено три контрольні перевірки без додавання цукрових буряків. Контейнери закривали гумовою пробкою та металевою кришкою та витримували в роторному шейкері з перемішуванням 130 об./хв при 37°С.

Загальне виробництво газу можна було визначити за допомогою визначення тиску в колбах у різний час витримування. Тиск вимірювався за допомогою цифрового вимірювача тиску GMH 3110 (Greisinger electronic GmbH, м. Регенштауф, Німеччина). Кількість виробленого метану визначалася за допомогою газової хроматографії з газового зразка, взятого одночасно з вимірюванням тиску. У 30 мл контейнер за допомогою шприца додавали 2 мл газу. Приєднавши колби до газового мішка після відбору проб, тиск у колбах зменшився до атмосферного тиску, а потім до нуля до наступного вимірювання.