Стійкість цукрових буряків до посухи: фізіологічні та молекулярні аспекти (частина 1)

 

Посуха — одна з основних причин скорочення врожайності цукрових буряків, а кліматичні прогнози свідчать про те, що негативна тенденція посушливих періодів буде продовжуватися й надалі. Стійкість до посухи є складною ознакою, яка включає як фізіологічні, так і молекулярні механізми в рослинах. У даному експерименті було досліджено 11 генотипів цукрових буряків, які виявляли різну стійкість до посухи в польових умовах. Експеримент складався з трьох частин: (І) дефіцит води, викликаний припиненням подачі зрошувальної води в тепличних умовах; (ІІ) дефіцит води, викликаний різними концентраціями поліетиленгліколю в рослинах, вирощених в умовах експлантації; та (ІІІ) аналіз порушень експресії генів у посушливих умовах. Рослини, які знаходилися в стресових умовах в теплиці, мали в середньому на три листка менше, на 4% менший вміст води та в 7 разів вищий вміст проліну. Класифікація генотипів на предмет їх стійкості до дефіциту води на основі концентрації вільного проліну, визначеного в лабораторних умовах, відповідала результатам тесту-спостереження, проведеного в польових умовах. Зміни в експресії генів-кандидатів під час посухи свідчать про те, що один із них може бути використаний для подальшого розвитку як ДНК-маркер. Ці результати можна застосувати при виведенні нових сортів цукрових буряків для підвищення їх стійкості до дефіциту води.

За матеріалами розділу на тему «Стійкість цукрових буряків до посухи: фізіологічні та молекулярні аспекти» («Sugar beet tolerance to drought: physiological and molecular aspects») книги «Рослина, абіотичний стрес та реакції на зміни клімату» («Plant, abiotic stress and responses to climate change») під редакцією Віолети Анжелькович, опублікованої 23 травня 2018 року.

Обсяг та розподіл опадів, необхідних для розвитку цукрових буряків

Для успішного виробництва цукрових буряків необхідно 600 мм опадів на рік. Крім того, в зимовий період для буряків потрібно близько 230 мм опадів, а в період їх вегетації (з квітня по жовтень) — приблизно 370 мм. Однак, виходячи з багаторічних даних про середню врожайність, виробництво цукрових буряків може досягти високих результатів, навіть, за наявності меншої (500 мм на рік) або більшої (1000 мм на рік) кількості опадів. У період вегетації потреба рослини у воді залежить від кількості опадів. Найбільші втрати води внаслідок випаровування припадають на період із червня по серпень, коли температура висока, а повітря сухе. Середній потенціал евапотранспірації (ЕТ) цукрових буряків становить 576 мм на період 30 років, але він може коливатися від 528 до 625 мм у залежності від погодних умов. Приблизно 10-20% від загальної потреби у воді цукрові буряки забезпечують із запасів ґрунтової води, а решту — за рахунок опадів та зрошення. Кількість втраченої в результаті транспірації води в середньому становить 392 мм та може коливатися від 198 мм у посушливі роки до 542 мм у дощові роки. Під час вегетаційного періоду (квітень-вересень) середній рівень опадів становить 359 мм і може варіюватися від 138 до 521 мм у певні роки.

З урахуванням вищезазначених фактів, кількість опадів та їх розподіл, у поєднанні з сонячним світлом та кількістю тепла, визначають якість та врожайність цукрових буряків. На території Сербії досить поширений дефіцит ґрунтової води, характерний для літніх місяців, який іноді проявляється в роки помірних опадів. Нестача ґрунтової вологи становить 100-200 мм на рік, але інколи може перевищувати 300 мм. У даний час у Сребії інтенсивно зрошуються менше 1% земель сільськогосподарського призначення, придатних для зрошення.

Клімат Сербії — континентальний або помірно-континентальний. Найважливішим районом-виробником цукрових буряків є Воєводина, розташований на півночі країни. Воєводина характеризується континентальним помірним кліматом, що визначається наявністю Альп, Дінарідів, Карпатських та Балканських гір. Режим опадів — континентальний, типовий для Дунайського регіону, з максимальним рівнем опадів влітку (червень) та мінімальним взимку.

За даними за минулий кліматологічний період, взимку 1971-2000 референтного періоду кількість опадів була вдвічі меншою від оптимальної, тоді як у період вегетації опади були трохи нижчими оптимальних значень. За даними модельного розрахунку клімату на періоди інтеграції 2001-2030, протягом перших десятиліть двадцятого століття очікувані середні річні опади не будуть суттєво відрізнятися від опадів 1971–2000 років (Таблиця 1). Перегляд опадів за період 2001-2014 рр. (Таблиця 2) підтверджує це очікування: 699,8 мм у м. Нові-Саді та 668,0 мм у м. Сомбор, порівняно з очікуваним середнім показником 2001-2030 рр. (Таблиця 1). Однак, важливо відмітити значну мінливість опадів у цей період, що відповідає кліматичним моделюванням 2001-2030 рр. Що стосується зимових та весняних опадів, для всіх періодів інтеграції кліматична модель імітує дещо вищу середнього рівня кількість опадів. До кінця століття очікується зменшення опадів під час вегетаційного періоду, особливо, влітку та збільшення їх мінливості.

Вплив дефіциту води на виробництво цукрових буряків

Дефіцит води під час вегетаційного періоду є досить серйозною проблемою для сільськогосподарського виробництва, одним із можливих вирішень якої є відбір генотипів, урожайність яких не скорочується нижче економічно прийнятного рівня в умовах водного дефіциту. У процесі відбору генотипів важким завданням є вибір належного ідіотипу рослин, підходящого для сучасних агроекологічних умов. Дефіцит води має комплексний вплив на фізіологію рослин. Першими проявом нестачі води в рослинах є втрата тургору та закриття продихів листків.  Процес фотосинтезу також значно залежить від водозабезпеченості рослин. Багато досліджень показали, що зменшення подачі води викликає скорочення вмісту води в асиміляційній тканині, що призводить до пригнічення фотосинтезу. Виходячи з цього, інтенсивність фотосинтезу визначається вологістю ґрунту, а також відносною вологістю повітря. Наслідком дефіциту води є зменшення розміру хлоропласту, збільшення числа продихів на одиницю площі листка та порушення структури тилакоїдної мембрани. Окрім скорочення вмісту води в тканинах, водний дефіцит може викликати синтез окремих сполук у коренях під час раннього етапу розвитку рослин. Відповідно до цього, корені є дуже важливими датчиками, чутливими до зміни ґрунту (не лише в плані води, але й щодо зміни його текстури), які попереджають надземні органи за допомогою "хімічних сигналів про посуху", які надходять в листя. Ці сигнали стосуються, здебільшого, рослинних гормонів, фітогормонів, таких як абсцизова кислота (ABA).

Таблиця 1. Кліматичні дані минулого (1971-2000 рр.) та майбутнього (2001-2030 рр. та 2071-2100 рр.) про опади в м. Нові-Сад та м. Сомбор, Сербія

Кліматичний період Щорічні Взимку Навесні Вегетаційний період
Опади (мм) Опади (мм) Коефіцієнт мінливості (%) Опади (мм)   Опади (мм) Коефіцієнт мінливості (%)
                                           м. Нові-Сад

1971-2000

2001-2030

2071-2100

604,1

641,8

560,5

108,1

131,3

131,0

46,2

56,1

54,5

146,6

159,7

147,4

33,3

34,7

37,0

359,2

369,2

282,2

28,8

26,1

32,0

                                           м. Сомбор

1971-2000

2001-2030

2071-2100

580,3

629,4

565,8

107,6

127,3

127,2

41,9

56,7

53,6

133,3

144,6

148,1

29,6

37,2

41,3

339,4

356,5

277,8

22,7

29,0

31,9

Таблиця 2. Щорічна кількість опадів за 2001–2014 рр. в м. Нові-Сад та м. Сомбор, Сербія

Рік м. Нові-Сад м. Сомбор

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

2014

Середній рівень

252

929

412

491

797

726

640

754

539

617

1035

382

480

723

989

679,8

231

749

448

434

816

753

585

683

598

615

994

401

446

692

932

653,3

Стійкість цукрових буряків до дефіциту води

Адаптація метаболізму рослин у стресових умовах є специфікою видів, яка була предметом численних досліджень. Стійкіші до посухи рослини мають довшу кореневу систему з більшою площею поглинання, краще розвинену фотосинтетичну паренхіму, товстішу серозну оболонку, меншу площу листя (ЛА) та кількість продихів, а також більшу щільність провідних елементів. Вони також мають високорозширювану протоплазму, більший вміст залишкової води та осмолітів, збільшене накопичення абсцизової кислоти (ABA), вільного проліну та аланіну. Наступні показники вказують на вищу фенотипічну стійкість цукрових буряків до дефіциту води: більш блискуча листова поверхня, кращий тургор черешка та  більш чутливе листя до розростання. Незважаючи на генотипічну мінливість щодо реакції цукрових буряків на посуху, структурні та морфологічні механізми все ще залишаються не зрозумілими.

Виникнення стресу на ранніх етапах розвитку цукрових буряків може негативно впливати на ріст коренеплодів та призводити до втрати до 46% врожаю. Крім того, пізніше виникнення стресу може спричиняти зменшення площі листя та кількості листків, а отже, зменшується ефективність використання сонячного світла. Дефіцит води помітно збільшує концентрації калію та натрію, які порушують виділення цукру з коренів. Реакцію рослин на водний стрес частково можна пояснити порушенням мінерального живлення. Фактично, дефіцит води може затримати або, навіть, зупинити засвоєння іонів, що призводить до відхилення від норми співвідношень іонів у певних тканинах. Ця тенденція проявляється через симптоми дефіциту іонів у рослинах. Негативний вплив водного стресу в пізніших фенофазах менше виражений, оскільки в рослин добре розвинена коренева система та листовий апарат, який повністю покриває ґрунт. Добре розвинена коренева система збільшує ефективність вилучення та засвоєння води, в результаті чого підвищується стійкість до водного дефіциту. Однак перші ознаки водного стресу зазвичай спостерігаються на листках. Незначне погіршення водного потенціалу листя може спричинити значне скорочення загальної листової площі, а низький водний потенціал стимулює появу нових листочків та прискорює старіння вже розвиненого листя. Стрес, викликаний посухою, призводить до закриття продихів, обмежує транспірацію, що підвищує температуру листя. Менше число продихів на одиницю площі листя та тепловий стрес погіршують результати фотосинтезу. Листя цукрових буряків має більшу кількість менших продихів на своїй нижній поверхні. Більша кількість та менший розмір продихів є способом пристосування до посухи, оскільки дозволяє рослинам бути більш ефективними в регулюванні переміщення води та транспірації. Доведено, що сорти, які краще переносять нестачу води, мають меншу кількість продихів на одиницю площі листка (70-150 продихів/мм2). Під час посухи, коли зменшується тургор у продихових клітинах, маленькі епідермальні клітини із затягнутими стінками підвищують стійкість рослин до водного стресу. Відсоток епідермісу верхньої та нижньої поверхні листя та товщина палісадної тканини також можуть впливати на реакцію генотипів цукрових буряків на посуху.

Хімічна реакція цукрових буряків на стрес, викликаний посухою

Рослини можуть осмотично пристосовуватися до посухи. Вплив дефіциту води призводить до накопичення осмолітів, таких як бетаїну, проліну та фруктанів. Ці речовини часто накопичуються у рослинах у вигляді сумісних осмолітів (сполуки, не задіяні в хімічних реакціях у рослинах, але впливають на водний потенціал клітин), які генерують експресію генів, кодуючи відповідні ферменти. Виробництво осмолітів та зміна осмотичного тиску можуть збільшити стійкість цукрових буряків до абіотичного стресу. Пролін та гліцинбетаїн допомагають у збереженні клітин, що робить їх придатними для подальшого дослідження з метою підвищення стресостійкості багатьох видів, включаючи цукровий буряк. Вони беруть участь у підтримці тургору та осмотичного балансу клітин, а також захищають структуру клітин від стресу. Однак залишається незрозумілим, чи рослини, які накопичують осмоліти, краще переносять дефіцит води, чи ні.

Накопичення проліну

Вільний пролін є ключовим метаболітом, який накопичується в цукрових буряках у посушливих умовах. Зміна концентрацій вільного проліну в тканинах є показником інших видів стресу, таких як температура, забруднення навколишнього середовища та незбалансоване живлення. Ті ж самі фактори можуть впливати на накопичення та вихід глюкози. У деяких випадках стресові умови можуть збільшувати якість цукрових буряків та потенціал виходу цукру, якщо рослини не зазнали сильної шкоди від дефіциту води.

Більша подача азоту збільшує вміст проліну, а також може збільшувати індекс листкової поверхні (LAI) та вплив стресу, викликаного посухою. Позитивна та значуща кореляція між вмістом проліну та глюкози в коренеплоді вказує на зв’язок між реакцією на стрес, вуглеводи та коефіцієнт накопичення проліну й глюкози. Це підтверджується впливом внесення ді-карвоментену (антитранспіранту) та DMDP (2,5-дигідроксиметил-3,4-дигідроксипіролідин, інгібітор глікозидаз), що знижувало вміст проліну в коренях зрошуваних цукрових буряків. Наявність таких сполук, як пролін та глюкоза, негативно впливає на кристалізацію цукру та призводить до утворення кольорових компонентів, тим самим знижуючи технологічну якість коренеплодів.

Пролін, накопичений у цукрових буряках, як з'єднання азоту, погіршує якість коренеплодів. Стрес та надлишок азоту призводять до концентрації накопичених вуглеводів, які є джерелом енергії, необхідної для пристосування до стресових умов. Більше того, хімічні речовини, що містять азот (наприклад, пролін), знижують вихід цукру та якість коренеплодів. Важливість накопичення проліну в осмотичній регуляції досі залишається не розгаданою і змінюється від одного виду до іншого. Найбільш інтенсивне накопичення проліну відбувається наприкінці росту цукрових буряків. Однак, співвідношення між посухою та вмістом проліну вказує на те, що зміна концентрації проліну є прийнятним показником стресу в цукрових буряках. Пролін може діяти як сигнальна молекула, яка змінює функцію мітохондрій, впливає на поділ клітин та експресію генів. Ця функція проліну може бути дуже корисною для відновлення рослин під час повернення сприятливих умов.

Застосування біотехнології рослин для збільшення стійкості до дефіциту води

Основна потреба стійкого виробництва продовольства спрямувала програми наукових досліджень на поліпшення ознак сільськогосподарських культур, незважаючи на обсяги та складність їх геному. Біотехнологія рослин — процес, під час якого використання молекулярних та цитологічних методів допомагає збільшити продуктивність рослин, поліпшити якість рослинної продукції та уникнути збитковості, заподіяної внаслідок впливу різних біотичних та абіотичних стресів. Селекція рослин, що опирається на використання молекулярних маркерів (маркерна селекція (MAS)), є однією з перспективних методик підвищення стійкості рослин. Необхідною умовою успіху MAS є визначення генів, які регулюють характерні досліджувані ознаки, та дослідження взаємозв'язків між потенційними маркерами та цими ознаками. Тільки тоді, коли маркер фізично розташований поблизу або, навіть, в межах цього гена, його можна ефективно використовувати в селекції.

Розробка селекційних програм, спрямованих на підвищення стійкості цукрових буряків до посухи, ще більше ускладнюється тим, що декілька видів абіотичних стресів часто виникають одночасно протягом вегетаційного періоду, і підхід, який передбачає маніпулювання групою генів для стійкості до посухи здається необхідним для вирішення цієї складної проблеми.

В епоху швидкого прогресу у виявленні та характеристиці повних сегментів геному рослин, білків, транскриптів, метаболітів, а також їх взаємодії в біологічній системі, нові відкриття призведуть до кращого розуміння і, можливо, до маніпулювання фізіологічними реакціями на водний дефіцит. Основною проблемою є визначення відносного внеску генів, які гарантують стійкість до посухи, та відокремлення тих генів, які не впливають на стресостійкість.

Незважаючи на те, що основною метою селекціонерів є врожайність, дуже складно точно передбачити можливість споживання води та визначити гени-кандидати для подальшого клонування. У декількох дослідженнях було визначено локуси кількісних ознак (QTL), пов'язаних із специфічним компонентом реакції на посуху. Хоча розробка молекулярних маркерів та геномне секвенування повинні прискорити позиційне картування, геномні ділянки, пов'язані з окремими QTL, все ще дуже великі і зазвичай не підходять для дослідження в селекційній програмі. Із швидким розвитком геномних технологій та відповідних статистичних методів збільшується інтерес до використання нових стратегій для ідентифікації генів, що кодують кількісні ознаки, які мають сільськогосподарське або, навіть, еволюційне значення. Ще одна серйозна проблема — як застосувати отримані знання для збільшення стійності рослин до стресових умов. Існує проблема між високою врожайністю та стійкістю до стресу, оскільки дуже часто в оптимальних умовах генотипи з більшою стійкістю до стресу мають меншу врожайність.

Адаптація рослин до стресу на клітинному рівні включає регуляцію початку синтезу білка, підвищення рівня антиоксидантів, тимчасове збільшення концентрацій ABA, зменшення способів споживання енергії, а також накопичення захисного білка. Усі ці зміни на клітинному рівні мають велике значення для підтримки гомеостазу після іонного дисбалансу, викликаного абіотичним стресом. Дефіцит води викликає синтез та накопичення ABA в рослинних клітинах, а також було визначено гени, що відповідають за цей процес. В останнє десятиліття було досягнуто значний прогрес у вивченні реакції рослин на абіотичний стрес.

Для поєднання високої врожайності та стійкості до стресу в одному сорті цукрових буряків, необхідно встановити зв’язок розвитку індивідуальних характеристик та взаємодій, що може бути досягнуто лише завдяки співпраці молекулярних біологів, фізіологів та селекціонерів. Необхідно визначити взаємозв'язок між різними морфологічними, анатомічними, фізіологічними та біохімічними ознаками тканин цукрових буряків на різних фазах їх росту та розвитку в різні періоди дефіциту води, щоб класифікувати генотипи відповідно до їх стійкості до посухи.

Матеріал та методи

Рослинний матеріал

У дослідженні було використано 11 генотипів цукрових буряків (позначено від 1 до 11), що відрізняються рівнем стійкості до посухи, згідно з тестом-спостереженням, проведеним у польових умовах. Відповідно до цього тесту, генотипи були розділені на три групи: (1) чутливі генотипи: 2, 5, 6 та 8; (2) помірно стійкі: 3, 7, 9 та 11; та (3) стійкі: 1, 4 та 10.

Експеримент проводився у три етапи:

  1. у напів-контрольованих умовах у теплиці;
  2. експлантація в лабораторних умовах;
  3. аналіз експресії генів, відповідальних за водний режим у листках (рослини з теплиці).

Експеримент у напів-контрольованих умовах у теплиці

Насіння цукрових буряків висівали в живильний субстрат Potgrond H (Klasmann), змішаний з річковим піском (17,5:1) у пластикових контейнерах (31 × 37 × 13 см). Один контейнер включав 12 рослин. Протягом 90-денного періоду вологість ґрунту утримувалася на рівні 80%, аналогічно до польових умов. Полив рослин проводився на основі евапотранспірації. Коли рослини досягали стадії 6-12 листків, їх піддавали дефіциту води шляхом припинення поливу, тоді як контрольні рослини продовжували поливати. Через п’ять днів було проведено молекулярні та фізіологічні аналізи.

Після висихання рослинної сировини при 105–130°С до її сталої маси було визначено % сухої речовини. Активність фотосинтетичного апарату визначалася за допомогою моніторингу F0(початковий), Fm (максимальний), Fv(змінний), Fv/Fm та t1/2 за допомогою вимірювача стресу рослин (PSM, BioMonitor S.C.I. AB). Концентрацію вільного проліну визначали в лабораторних та природних умовах. Концентрацію хлоропластних пігментів визначали спектрофотометрично. Площа листя (LA) вимірювалася автоматичним вимірювачем LI-3000 (LI-COR, США).

Лабораторний експеримент в умовах експлантації

У цьому експерименті використовували основний субстрат MS із 0,3 мг/л BA (бензиладеніну) та 0,01 мг/л GA3 (гіберелінової кислоти). Для отримання достатньої кількості бічних пагонів одного розміру, кожні 3 тижні проводилося субкультивування (пасажування). Нестача води була викликана додаванням поліетиленгліколю (PEG) до субстрату. Отримані пагони поміщалися в субстрат для мікророзмноження з 0, 3 та 5% поліетиленгліколю (PEG 6000, Duchefa, Нідерланди). Рослини вирощувалися в цьому субстраті протягом 4 тижнів, після чого визначалася свіжа маса пагонів, а також суха речовина та вміст вільного проліну. Під час експерименту в камері з кондиціонуванням повітря температура становила 21-23°C з тривалістю світлового дня 16 год. та 8 год. темряви.

Аналіз експресії генів, відповідальних за водний режим у листках (рослини з теплиці)

Було проаналізовано зміни експресії генів в листках цукрових буряків, вирощених у тепличних умовах. Із попередніх досліджень було відібрано гени-кандидати. Щодо 13 генів-кандидатів, які, як вважається, беруть участь в реакціях на осмотичний та сольовий стрес, для перевірки поліморфізмів на рівні ДНК та експресії генів було сконструйовано та використано праймери. Десять відібраних генів-кандидатів були гомологічними зондами (BI543470, BI096135, AW697770, BI543640, BG932913, BI096146, BQ060651, BF011094, BI096078 та BF011254), а також гетерологічними зондами з кукурудзи (X15290), люцерни (BI543243) та моркви (BI073246). Зразки для аналізу ДНК/РНК (листя) були відібрані через 5 днів після останнього поливу (експеримент 1) та використані для екстракцій ДНК/мРНК. мРНК використовували для синтезу кДНК, і ця кДНК була основою для подальших полімеразних ланцюгових реакцій (ПЛР).

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз даних проводився різними статистичними методами. ANOVA застосовували для фотосинтетичних пігментів (MCMCglmm Methods), використовуючи Package R (https://www.jstatsoft.org/v33/i02/). Логарифмічні перетворення та перетворення Джонсона (Minitab) застосовувалися  для параметрів із великою мінливістю даних, щоб нормалізувати їх розподіл. Довірчий діапазон для відповідних середніх когефіцієнтів було обчислено у вигляді квантилів модельованих розподілів очікуваних величин реакції.


1956