Мікробіомна ідентифікація мікробних індикаторів кагатних гнилей цукрових буряків
Мікроорганізми, що колонізують рослини, живуть у тісному зв’язку зі своїм господарем і випливають на їх ріст та санітарний стан. Для різних культурних рослин цей вплив спостерігається по всьому виробничому ланцюжку, включаючи період після збирання врожаю — зберігання. Дослідження зв’язку рослин та мікробів, корисних для рослин бактерій та грибів, включаючи дріжджі, їх функцій та способи дії, є ключем до передових розробок, пов’язаних із застосуваннями біотехнології в сільському господарстві. Однак застосування біологічних препаратів під час зберігання буряків є досить непростим завданням через велике розмаїття кагатних патогенів, а також часто дуже складних обробок та умов зберігання зібраного врожаю. Трав'яниста дводольна рослина Beta vulgaris (цукровий буряк) є основною культурою для виробництва цукру (вміст цукру до 18%) у всіх регіонах помірного кліматичного поясу. Але існує цілий ряд патогенів рослин, таких як Pythium ultimum, Rhizoctonia solani та Cercospora beticola, які спричиняють серйозні втрати врожаю через розвиток гнилей у фазі сходів буряків або пізньої кореневої гнилі в кагаті (кагатні гнилі).
За матеріалами статті на тему «Мікробіомна ідентифікація мікробних індикаторів кагатних гнилей цукрових буряків» («Microbiome-driven identification of microbial indicators for postharvest diseases of sugar beets») онлайн журналу «Мікробіом» («Microbiome»), 7 (2019).
В Європі починаючи з кінця жовтня після збирання врожаю цукрові буряки зберігаються безпосередньо на полях максимум 60 днів через обмежені потужності переробки заводів. А високий вміст води (76%) та цукру (18%) у непереробленому буряку забезпечують ідеальні умови для мікробної колонізації, особливо, коли поверхня коренеплоду вкривається тріщинами, зламується кінчик кореня та є «свіжі ранки», які забезпечують легкі точки входу інфекцій. Мікробна колонізація, переважно патогенними або сапрофітними грибами, такими як фузаріоз, пеніцилій і ботрітіс, призводить до значних втрат цукру. Основним спостережуваним явищем є мікробний розпад сахарози в небажані молекули глюкози та фруктози. Поєднання мікробіологічного розкладання, дихання кореня буряка, синтезу рафінози тощо може призвести до втрати 50-60% цукру під час зберігання.
Природні антагоністи, які є частиною кореневого мікробіома буряка, несуть у собі потенціал альтернативних засобів захисту рослин під час вегетаційного сезону та протягом усього періоду зберігання зібраного врожаю. У попередніх дослідженнях було виявлено відповідність між захворюваністю на полях цукрових буряків та антагоністичним потенціалом мікробіоти. Ці спостереження становлять основу для стійких методів запобігання значним втратам цукру, спричиненим грибковими інфекціями, з цільовим використанням антагоністичних мікроорганізмів, які також можуть забезпечити захист буряків на зберіганні. Однак для розробки цільових та доцільних заходів протидії надзвичайно важливо визначити ключових збудників розвитку гнилей та покращити стратегії їх раннього виявлення в бурякових кагатах. Більше того, під час біологічного контролю важливо розуміти, до яких природних аналогів входять корисні мікроорганізми. Незважаючи на те, що патогенні гриби, що викликають гниття, ідентифіковані, динаміка розвитку бактерій та грибів під час зберігання цукрових буряків не вивчена.
Мета дослідження — проаналізувати тимчасові зміни у мікробіомі цукрових буряків під час їх зберігання, співвіднести їх зі станом цукрового буряка та, нарешті, інтегрувати отримані знання у новий спосіб виявлення хвороб.
Тому досліджувався бактеріальний та грибковий мікробіом цукрових буряків на зберіганні у різних кагатах, розташованих у важливих виробничих районах Австрії та Німеччини. Проводячи детальну оцінку мікробіома цукрових буряків у кагатах, були виявлені специфічні біологічні маркери, які вказують на розвиток хвороби. Потім ці спостереження були підтверджені на прикладі цукрових буряків, які зберігалися в контрольованих умовах, для перевірки даних маркерів. Загальні результати дають основу для розробки нових способів захисту буряків на зберіганні, які впроваджують мікробні та молекулярні маркери для цілеспрямованих заходів протидії розвитку кагатних гнилей.
Ідентифікація грибкових таксонів у гниючих цукрових буряках
Для того, щоб ідентифікувати таксони грибів в інфікованих буряках із кагатів в Австрії та Німеччині, було застосовано два методи. Структуру популяції було змінено за допомогою секвенування по Сенгеру фрагментів гену 18S рРНК з грибкових ізолятів та за допомогою ампліконового секвенування ITS Illumina загальної ДНК популяції (Рис. 1). Зміна популяції на основі секвенування 18S рРНК із 120 штамами грибів показала структуру грибкової популяції з 11 різними видами, де переважали пеніциліум (37%) та фузаріоз (22%), тоді як ампліконове секвенування ІТS вказувало на більш різноманітний склад популяції. Загалом у 80 наборах даних ампліконів було виявлено більше 50 різних грибкових видів. Найбільш помітні види були віднесені до родів Plectosphaerella (11%), Guehomyces (10%), Penicillium (10%), Candida (10%), Mrakia (8%), Vishniacozyma (8%) та Tetracladium (4%). Хоча в обох випадках було виявлено багато пеніцилію, фузаріум переважав лише в зміні популяції з використанням ізолятів. Більше того, найбільша частка штамів грибів (86%) була вилучена з поверхні буряків; проте значна частина ідентифікованих видів фузаріозу (39%) походить з внутрішніх шарів коренеплоду.
Рис. 1. Порівняння результатів секвенування фрагментів гену 18S рРНК грибкових штамів, отриманих із бурякових кагатів в Австрії та Німеччині, та ITS-секвенування зразків амплікону. Отримані секвенування були віднесені до рівня родів. Кольорові сегменти вказують на різні роди в обох наборах даних. Затінені ділянки являють собою частку грибкових ізолятів, отриманих із внутрішніх шарів коренеплоду.
Скорочення мікробного різноманіття у гнилих буряках
Порівняння даних ампліконів, отриманих із 120 зразків здорових та гнилих буряків, показало істотно меншу бактеріальну різноманітність у заражених зразках (індекс різноманіття Шеннона: 4,5 (16S) та 3,5 (ІТS)), порівняно з мікробіомом здорових буряків (індекс Шеннона: 5,5 (16S) та 4,5 (ITS)) (Рис. 2b). Індекс Брея-Кертіса показав значні відмінності у складі мікробіомів двох груп. Під час групового порівняння зразки гниючих цукрових буряків (n = 80) значно (значення p ≤ 0,01) відрізнялися від здорових зразків (n = 40). Було виявлено, що варіації в межах інфікованої групи були вищими, порівняно зі здоровими зразками (Рис. 2а).
Рис. 2. Порівняння альфа- та бета-різноманітності здорових зразків мікробіомів цукрового буряка. Бактеріальний та грибковий мікробіом кожного зразка позначений однією крапкою (а). Дуже суттєві відмінності у різноманітті були отримані із загалом 40 здорових та 80 гнилих зразків (b). Відстані, показані на графіку PCoA, базуються на Індексі Брея-Кертіса.
Зміна складу основного мікробіому в гниючих буряках
Таксономічні призначення виявлених ознак свідчать про специфічний гниючий мікробіом буряків. Порівняння здорових і згнилих зразків показало чітко видомий склад таксонів як у бактеріальних, так і в грибкових ампліконах. Протеобактерії з середньою відносною чисельністю 41% (здорові зразки) та 51% (гниючі зразки) були найбільш поширеними таксонами на рівні типів. В обох групах також було багато Bacteriodetes (27% та 12,5%) та Actinobacteria (28% та 11%). Основна відмінність між обома групами зумовлена типом Firmicutes (0,4% у здорових та 25% у гнилих зразках). Основна частка Firmicutes у гниючих зразках належала до Lactobacillales (24%). Переважаючі Proteobaceria у здорових зразках були переважно представниками Pseudomonadales (10%), Sphingomonadales (9%), Rhizobiales (8,5%), Xanthomonadales (6,5%) та Enterobacteriales (2,5%).
На відміну від цього, 51% Proteobacteria, виявлених у гниючих зразках, належали до Rhodospirillales (20%), Enterobacteriales (8%), Pseudomonadales (8%), Xanthomonadales (5%), Sphingomonadales (4%) та Rhizobiales (4%). На рівні порядку найбільш поширеними таксонами в здорових буряках були Flavobacteriales (21%), Micrococcales (21%) та Pseudomonadales (10%), тоді як у гниючих буряках переважали Lactobacillales (24%), Rhodospirillales (20) %) та Flavobacteriales (9%). На рівні роду Lactobacillus (18,4%), Gluconobacter (16%) та Leuconostoc (11,3%) були найпоширенішими таксонами у гнилих зразках, тоді як у здорових зразках — Flavobacterium (20,6%), Pseudarthrobacter (13,5%) та Pseudomonas (9%) (Рис. 3а).
Рис. 3. Основний мікробіом здорових і гниючих цукрових буряків із кагатів в Австрії та Німеччині. Показано відносну кількість поширених таксонів бактерій (а) та грибів (b). Усі таксони з кількістю ≥ 1% були ідентифіковані на рівні роду, якщо роздільна здатність була достатньою. Групування було здійснено на рівні класу, а таксони, які не були згруповані на рівні роду, позначалися додатково: f_: родина, o_: порядок, c_: клас, p_: тип, k_: царство.
Набір даних ITS показав різні грибкові мікробіоми як у здорових, так і в гниючих цукрових буряках. Після оцінки структури всього набору даних загалом у грибній популяції спостерігалося 60-62% Ascomycota та 33% Basidiomycota. На рівні класу було виявлено підвищену частку Saccharomycetes (+10%; загалом 12%) та Eurotiomycetes (+9%; загалом 10%), а також зменшену частку Sordariomycetes (-16%; загалом 24%) у гниючих зразках. На рівні порядку спостерігалося збільшення кількості Cystofilobasidiales (+11%; загалом 21%), Saccharomycetales (+10%; загалом 12%) та Eurotiales (+9,5%; загалом 10%). На рівні роду це призвело до збільшення кількості Candida (+7,5%; всього 9,5%), Penicillium (+9,5%; загалом 10%), Guehomyces (+5%; загалом 10%) та Mrakia (+5%; всього 8%). Здорові зразки, навпаки, показали збільшення чисельності родів Plectosphaerella (+10%; всього 21%), а також Vishniacozyma (+12%; загалом 18%). Це вже було виявлено у збільшенні кількості класів Sordariomycetes (+16%; загалом 40%), а також Tremellomycetes (+2%; загалом 30%). Для порівняння, на рівні роду найбільш поширеними у гниючих зразках були Plectosphaerella, Guehomyces, Candida та Penicillium (усі 10%), тоді як у здорових зразках переважали роди Plectosphaerella (21%) та Vishniacozyma (18%) (Рис. 3b).
Трофічний профіль грибкового мікробіому
Було виявлено, що таксономічні відмінності між здоровими та гниючими буряками супроводжуються змінами в трофічних режимах виявлених основних ознак. Здорові зразки колонізували переважно патотрофні (24%) та патотрофно-сапротрофно-симбіотрофні (26%) гриби.
Однак у трофічному розподілі гниючих зразків переважали сапротрофні гриби (39%) зі зменшеною часткою патотрофних (14%) та патотрофно-сапротрофно-симбіотрофних (12%) грибів. В цілому спостерігалося зменшення патотрофних та симбіотрофних функцій та збільшення сапротрофних функцій від мікробіома у здорових до мікробіому у гниючих цукрових буряках (Рис. 4а).
Санітарний стан буряків — важливий фактор складу мікробної популяції
Порівняння шести кагатів буряків в Австрії та Німеччині показало значні відмінності у мікробної різноманітності та таксономічному складі. Санітарний стан пояснює найбільшу частку варіації буряків (33,3% — в наборі даних 16S та 20,9% — для ITS, p ≤ 0,001).
Зразки, відібрані з кагату в Гроссмуглі (Австрія), показали чіткі відмінності у мікробному складі, у порівнянні зі зразками буряків, відібраними з кагату в Німеччині. Однак зразки, які були географічно розташовані ближче один до одного, показали менш суттєві відмінності. Загалом, зміна від відносно збалансованої кількості бактеріальних таксонів (мікробіом здорових цукрових буряків) до переважання Lactobacillales, а також Rhodospirillales (гниючі цукрові буряки) була очевидною для кожного місця відбору проб. Грибна популяція варіювалася від мікробіома, де переважали Vishniacozyma та Plectospaerella, до зростаючої кількості видів Penicillium та Candida (Рис. 5).
Рис. 5. Відносна кількість найпоширеніших (≥ 5%) бактеріальних та грибкових таксонів у здорових та гниючих зразках цукрових буряків. Відібрані зразки цукрових буряків із шести кагатів в Австрії та Німеччині аналізувалися шляхом ампліконного секвенування фрагмента гена 16S рРНК та області ІТS. Результати були згруповані відповідно до санітарного стану та місця відбору проб буряків.
Визначення показників захворюваності та співвідношення із вмістом цукру у буряках на зберіганні
Специфічні таксони, що вказують на мікробіом здорових або гнилих цукрових буряків, були відібрані на основі відмінностей у їх кількості в представлених зразках (Рис. 3 та 5). У здорових буряках серед бактерій домінували Flavobacterium та Pseudarthrobacter, а також гриби Plectospaerella та Vishniacozyma. На відміну від цього, у гниючих зразках були поширені Lactobacillus та Gluconobacter, а також Candida та Penicillium. Аналіз на визначення кількісної полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу з конкретними праймерами, орієнтованими на мікробні показники у цукрових буряках на зберіганні показав поступове збільшення показників захворювання та одночасне погіршення показників санітарного стану рослин.
Тримісячне дослідження показало збільшення Candida (від 105 до 5 × 106 копій/г), Fusarium (від 2 × 103 до 104 копій/г) та Penicillium (від 0 до 104 копій/г) та одночасне зменшення кількості Vishniacozyma (від 105 до 5 × 104 копій/г) (Рис. 6а). У випадку Plectosphaerella, спочатку відбувалося зменшення її кількості (від 2 × 105 до 105 копій/г), після чого виявлялася загальна постійна кількість (105 копій/г) протягом усього періоду зберігання.
Для того, щоб перевірити розвиток захворювання проводилися додаткові аналітичні аналізи вуглеводів у буряках на зберіганні. Вміст цукру в буряках, що зберігалися в контрольованих умовах, показав зниження концентрації сахарози (-3%) протягом тривалого терміну зберігання. Водночас спостерігалося збільшення інвертованого цукру (глюкози (від 2 до 14 г/кг) та фруктози (від 1,5 до 14 г/кг)) (Рис. 6b).
Рис. 6. Аналіз кількісної полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу бактеріальних та грибкових таксонів у складі цукрових буряків (а) та аналіз вмісту сахарози, глюкози та фруктози у цукрових буряках (b). Число копій генів на грам поверхні цукрового буряка демонструє чіткі тенденції, пов'язані з показниками санітарного стану та розвитку хвороб протягом трьох місяців контрольованого зберігання (градієнт кольору). Статистичну значущість між першим та останнім вимірами перевіряли за допомогою параметричного t-критерію Стьюдента: значення p <0,01**; p <0,05 *.
Зменшення різноманітності бактерій супроводжується появою кількох родів
Раніше було показано, що мікробне різноманіття, а також чіткі зміни у мікробній популяції пов’язані із розвитком захворювання. Дані, отримані в даному дослідженні, підтверджують гіпотезу про те, що менша різноманітність бактеріальної та грибкової популяцій пов'язана з більшою чутливістю до зрушень мікробіому, що істотно змінює структуру популяції. Низька різноманітність у гниючих зразках була відображена значним зменшенням показників різноманітності як у наборі даних бактерій, так і грибів. Крім того, було показано, що зменшення різноманітності сприяє інвазії патогенних видів у популяціях грибів та бактерій.
Незважаючи на те, що на секвенування на основі ампліконів можуть впливати певні розбіжності, таксономічний склад бактеріального та грибного мікробіома буряків, отриманий за допомогою цього набору даних, був насамперед пов’язаний із санітарним станом зразків цукрових буряків. Географічне розташування бурякових кагатів відіграло менш значну роль для спостережуваної мінливості. Крім того, в 2016 році вже спостерігався подібний ефект при зберіганні цукрових буряків при різних температурах. Залежно від умов зберігання, аналізований буряк містив специфічні таксони грибів. У дослідженні цукрові буряки, що зберігалися в характерних умовах без будь-якого захисту від несприятливих факторів навколишнього середовища (вологи, коливань температури, заморозків тощо), виявили грибну популяцію, де переважали Candida, Penicillium, Guehomyces та Plectosphaerella у гниючих зразках. Спостережувані таксономічні зміни також відображалися трофічними режимами всередині грибної популяції. Домінуючі патотрофні та патотрофно-сапротрофно-симбіотрофні функції у здорових зразках замінювалися сапротрофними функціями у гниючих буряках.
Визначення показників санітарного стану в мікробіомі цукрових буряків
Різні потенційні біологічні маркери були виявлені шляхом розпізнавання здорових і хворих зразків цукрових буряків на зберіганні. Було показано, що окремі таксони були широко поширеними в зразках, що представляють кожен вид захворювання. Раніше було показано, що некротрофний рід грибів Plectosphaerella, виявлений у здорових буряках, є мікробом, що стимулює ріст буряків. Крім того, раніше повідомлялося, що він є потенційним агентом біологічного захисту картоплі від цистової нематоди, а також потенційним біогербіцидом. Попередні дослідження зберігання цукрових буряків виявили, що цей таксон переважав у цукрових буряках до початку їх зберігання.
Інші таксони, пов'язані з санітарним станом рослин, такі як Flavobacterium та Pseudarthrobacter, часто зустрічалися в прикореневій зоні різних рослин, а також брали участь у механізмах захисту або стимулюванні росту рослин. Таксони, асоційовані з гниючими буряками, такі як Penicillium, є типовими сапрофітними грибами та збудниками хвороб зберігання та спостерігалися у гнилих буряках після збирання врожаю. Lactobacillus, а також рід грибів Candida були виявлені переважно в гниючих буряках і пов'язані з розчепленням цукрів до кислотних або спиртових сполук і через цю активність вони є небажаними у цукрових буряках під час їх зберігання. Можна висунути гіпотезу, що такі таксони виникають у гниючих буряках насамперед через збільшення вільних моносахаридів, що утворюються в ході процесів гідролізу сахарози позаклітинними грибковими формами білків.
Аналіз кількісної полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу, проведений на основі ідентифікованих показників санітарного стану та хвороб цукрових буряків на зберіганні, став першим доказом застосовності таких показників до стратегій ведення сільського господарства. Протягом зберігання показники, пов’язані з санітарним станом рослин, або зменшувалися, або залишалися незмінними. На відміну від цього, показники, пов'язані з хворобами, значно зросли. Кількісний аналіз цих таксонів вказує на поступовий розвиток хвороби, пов'язаний із мікробною втратою концентрації сахарози та одночасним збільшенням інвертованого цукру під час зберігання.
Висновки
Кагатні гнилі цукрових буряків супроводжуються змінами в мікробних популяціях. У даному дослідженні висвітлено значні зрушення всередині бактеріальної та грибкової популяцій, які пов’язані з інтенсивністю процесів гниття буряків. Зміни у поширеності деяких таксонів потенційно можуть свідчити про розвиток гнилі на ранній стадії та сприяти впровадженню відповідних заходів для боротьби з даною проблемою. Було показано, що таксономічні зміни супроводжуються трофічним профілем грибної популяції. Отримані дані дають основу для розробки відповідних агентів біоконтролю, що підтримують баланс таксонів, пов'язаних із мікробіомом здорових цукрових буряків та запобігають утворенню мікроорганізмів-збудників гниття. Крім того, ідентифікація показників хвороби може використовуватися як інструмент для прийняття правильних рішень та підтримки пріоритетності обробок зібраного буряка під час зберігання.