Біохімія, що лежить в основі технології виробництва та механічної обробки насіння цукрових буряків (частина 1)

 

Промислова переробка для отримання високоякісного промислового насіння цукрових буряків включає видалення хімічних інгібіторів росту та є необхідною умовою для отримання рівномірних сходів та високого потенціалу врожайності. Під час виробництва насіння цукровий буряк (Beta vulgaris), основне джерело цукру в сільськогосподарській зоні помірного клімату, зазвичай проходить кілька етапів обробки для поліпшення проростання насіння та розвитку сходів.

Дослідження проростання та розвитку сходів проводилося на необробленому та обробленому насінні цукрових буряків. Розчинні речовини, одержані з перикарпу, відомі тим, що пригнічують проростання, перевірялися під час аналізу проростання, визначалася їх осмотичність та провідність (іони). Визначався вміст абсцизової кислоти (AБК) та її метаболітів як у самому насіння, так і в тканині перикарпу. Фізичні зміни в структурі перикарпу оцінювалися за допомогою скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Було виявлено, що шліфування та промивання насіння цукрових буряків позитивно впливає на проростання насіння та розвиток сходів. Механічна дія шліфування видалила зовнішню тканину перикарпу (насіннєву оболонку) (паренхіму), залишивши внутрішню тканину (склеренхіму) без змін, як було виявлено за допомогою скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Шліфуванням, а також промиванням видалили інгібітори росту з перикарпу, зокрема, абсцизову кислоту (АБК), її метаболіти та іони. Розуміння біохімії, що лежить в основі ефективності цих процесів, є ключем до подальших інновацій для поліпшення якості промислового насіння.

За матеріалами статті на тему «Біохімія, що лежить в основі технології виробництва та механічної обробки промислового насіння цукрових буряків» («The biochemistry underpinning industrial seed technology and mechanical processing of sugar beet») міжнародного журналу з біології рослин «Planta» (2019).

Після збирання сухого насіння застосовуються інноваційні технології виробництва, такі як очищення, сортування за розмірами, промивання, сушіння, очищення від лушпиння, шліфування, праймінг, дражування або гранулювання. У промисловому насінництві використовуються технології промивання, очищення від лушпиння та шліфування для покращення проростання насіння шляхом усунення фізичних («твердість») та хімічних (інгібіторів росту, таких як абсцизової кислоти (АБК) та її метаболітів) обмежень. Модифікація перикарпа (насіннєвої оболонки) також використовується для зменшення зараження патогенами, локалізованими в перикарпі.

Цукровий буряк — це рослина з родини Щирицевих (Amaranthaceae), яка є культурою, що має значення глобального характеру, оскільки є основним джерелом цукру в помірному кліматичному поясі. Щороку він забезпечує до 30% світового виробництва цукру.

Технологія промислового виробництва та механічної обробки насіння цукрових буряків має значний вплив на перикарп, але бракує інформації про біохімічні механізми, що лежать в основі цих процесів. Перикарп зібраного, необробленого сухого насіння цукрового буряка складається з кількох клітинних шарів із двома найбільш помітними: внутрішнім шаром товстостінних клітин склеренхіми та пористим зовнішнім шаром великих клітин паренхіми. Оперкулюм — це кришкоподібна структура у верхній частині перикарпа (Рис. 1). Базальна пора розташована на нижній частині перикарпа, це пориста структура, що складається з рихлих клітин. Оперкулюм і базальна пора, ймовірно, є основними точками поглинання води та кисню під час проростання насіння.

 

Рис. 1. a Дозріле насіння Beta vulgaris. Насіння цукрових буряків оточене насіннєвою оболонкою (перикарпом), що має кришкоподібну структуру (оперкулюм). Насіння складається із зародка та покривних шарів (ендосперм і теста). Вигнутий зародок оточує тканину перисперм материнського походження. b Огляд необробленого та обробленого насіння цукрового буряка (Beta vulgaris) (зліва та посередині). Праворуч зображено насіння цукрового буряка в поперечному перерізі, що показує саме насіння всередині перикарпу. c Схема демонструє процес промислової переробки насіння цукрових буряків (від збирання до отримання готового для виходу в продажі дражованого насіння), включаючи етапи шліфування та промивання.

Промислове виробництво цукрових буряків є трудомістким процесом, що вимагає великих посівних площ, а також тривалого та стабільного вегетаційного періоду. Фермери вимагають “насіння” найвищої якості та схожості. Щоб задовольнити цей попит, застосовуються дорогі технології переробки в насіннєвій галузі, які сприяють високій ринковій вартості бурякового насіння. Під час виробництва насіння застосовуються різні обробки для покращення характеристик його якості для оптимального проростання та розвитку сходів. Такі обробки часто позитивно впливають на проростання насіння цукрових буряків, збільшуючи швидкість його проростання, а також забезпечуючи рівномірність сходів у польових умовах.

У даній роботі ми зосереджуємось на двох видах обробки — шліфуванні та промиванні. Шліфування використовується для видалення частин тканини перикарпу, що призводить до зміни розміру та форми насіння після виявлення будь-яких пошкоджень всередині насіння для наступного процесу дражування. Часткове видалення перикарпу шліфуванням також призводить до покращення проростання насіння. Промивання, застосоване після шліфування, часто є необхідною умовою перед процесом дражування, так як воно покращує якість насіння, ймовірно, вимиваючи інгібітори росту з залишків перикарпу. Шліфування та промивання — це два поширених способи обробки насіння, які використовуються в насіннєвій галузі, адже відомо, що вони позитивно впливають на проростання. Хоча ці обробки часто застосовуються під час виробництва насіння цукрових буряків, мало відомо про те, як вони впливають на біохімічні властивості перикарпу. Чи усувають вони фізико-хімічні обмеження, включаючи інгібітори росту, для покращення проростання? Які зі змін властивостей насіння визначають ефективність застосовуваного методу?

Дана робота спрямована на дослідження фізіологічних та біохімічних основ процесів шліфування та промивання, в порівнянні з необробленим насінням цукрових буряків. Аналізується, як ці технології впливають на ефективність проростання, вміст інгібіторів у перикарпі, абсцизової кислоти (AБК), її метаболітів та іонів у зв'язку з морфологічними змінами в перикарпі, викликаними шліфуванням та промиванням.

Матеріали та методи
Рослинний матеріал

Насіння цукрових буряків (Beta vulgaris), партії А та В, поставляла компанія KWS SAAT SE & Co. Партії А та В — це різні генотипи, які не мають спільного елемента у батьківських лініях. Партія А вирощувалася у Франції, а партія В — в Італії. Обидві партії насіння було вирощено та отримано влітку 2014 року. У процесі збирання зрілі рослини зрізаються і висушуються на сонці. Після обмолоту рослин, у випадку необхідності, насіння висушувалося до < 10% вологості. Зібране та висушене насіння піддавалося (попередньому) очищенню та калібруванню (поділу на фракції за розмірами). Згодом партії відкаліброваного насіння піддавалися процесу шліфування, використовуючи спеціальний пристрій для лущення насіння цукрових буряків шляхом контакту насіння з абразивним матеріалом. Процес був спеціально відрегульований для обох генотипів для досягнення хороших результатів шліфування (зменшений перикарп; кругла форма; необхідний розмір), а також уникнення будь-яких пошкоджень (непропорційна форма чи розмір насіння), які негативно впливають на ефективність проростання насіння. Крім того, видалення перикарпу зменшує кількість властивих йому інгібіторів проростання, що ще більше посилюється шляхом послідовної процедури промивання. Зразки для експериментальних порівнянь позначалися як «необроблені» (без шліфування та промивання), «відшліфовані» (без промивання) та «відшліфовані + промиті». Вміст вологи, виражений у відсотках, визначався шляхом вимірювання зменшення маси насіння після його сушіння протягом 8 год при 105°С, а потім поділом на суху масу для 5 повторень по 15 насінин та обчисленням середнього значення. Період висихання насіння тривав вісім годин, оскільки не було значного, вимірюваного зменшення маси за цей проміжок часу.

Аналіз проростання

Дослідження проростання проводилося в темряві при 10°C (термостат MIR-254-PE, Panasonic, Осака, Японія). Умови 10°C і темрява — це загальноприйнятий галузевий стандарт, який представляє недостатньо оптимальні умови, які, як було виявлено, краще корелюють з польовою схожістю, ніж дослідження, проведені при більш оптимальних температурах. Насіння цукрових буряків пророщувалося у білих пластикових коробках (180 × 135 × 65 мм) з прозорими кришками, що містили аркуш фільтрувального паперу та гофрований фільтрувальний папір, які розділяють і забезпечують рівномірне поглинання води насінням. Чотири копії (коробки), кожна з яких містила по 50 насінин цукрового буряку та 30 мл дистильованої води (dH20), використовувалися для визначення проростання кожної з партій бурякового насіння (А та В). У цьому аналізі та у всіх наступних аналізах проростання визначалося як корінець (його верхівка), що виступає через і за межі оперкулюму. Ці аналізи проростання використовувалися для порівняння впливу різних обробок на насіння (необроблене, відшліфоване, відшліфоване + промите).

Визначення розвитку сходів

Розвиток сходів визначався в обох партіях насіння (А та В) шляхом пророщування насіння цукрового буряка. Сходи було отримано через 13 днів при 10 °С після 3 днів при 20°С в темряві. Звичайні сходи визначалися як паростки, які мають корінь без зміни кольору, прямий гіпокотиль та обидві сім’ядолі присутні та відкриті. Були зроблені фотографії прикладів нормальних/ненормальних сходів.

Визначення проростання за допомогою промивної води перикарпу

Промивна вода перикарпу була отримана шляхом подрібнення та вилучення перикарпу з необробленого насіння цукрових буряків (партії А та В), а потім суспендуванням подрібненого перикарпу в dH2O у співвідношенні 1:10 у 50 мл пробірці (Sarstedt AG & Co. KG, Нюмбрехт, Німеччина). Потім водяна суспензія перикарпу перемішувалася протягом 8 год при 200 об./хв на лабораторному роторі моделі G2 (New Brunswick Scientific, США). Потім матеріал перикарпу видаляли центрифугуванням (Eppendorf 5430R, Гамбург, Німеччина) протягом 5 хв при 2500 об./хв (734 г). Промивну воду з партій А та В не змішували. Осмоляльність промивної води аналізувалася за допомогою осмометра типу ОМ 806 (Loeser Messtechnik, Берлін, Німеччина), а провідність — за допомогою вимірювача провідності Jenway 4510 (Коул-Пармер-Сент-Неотс, Великобританія).

Дослідження проростання проводилося у чашках Петрі діаметром 9 см, покритих двома фільтрувальними паперами ∅85 мм (MN 713, Macherey – Nagel, Düren, Німеччина) з 3 мл промивної води перикарпу, 0,1 ммоль абсцизової кислоти (АБК), 100 ммоль NaCl або dH2O (контроль) відповідно. Три чашки Петрі, що містили 25 насінин, готували для кожної обробки та витримували при 10°С у темряві (Panasonic MIR-254-PE). Усе насіння висівалося оперкулюмом догори (і базальною порою вниз), оскільки орієнтація може впливати на його проростання.

Результати
Порівняльний аналіз впливу шліфування та промивання на проростання насіння та розвиток сходів цукрових буряків

Промислова переробка насіння цукрового буряка («необробленого») шляхом шліфування («відшліфованого») видалила значну кількість зовнішньої тканини перикарпу, як показано на Рис. 1b. Кількісна оцінка показала, що шліфування зменшило розмір насінин (площа поперечного перерізу) на  44% для партії А та на ~ 49% для партії В, а також зменшило масу насіння на 27% та 23% відповідно (Таблиця 1). «Відшліфоване + промите» насіння висушувалося після етапу промивання. У зв’язку з цим «відшліфоване» та «відшліфоване + промите» насіння не відрізнялися суттєво за розміром та масою, а все насіння мало однаковий вміст вологи ~ 8,5% (Таблиця 1). Щоб визначити, як шліфування та промивання вплинули на насіння двох партій, проводився аналіз проростання.

На Рис. 2 показано, що час, необхідний для завершення проростання, був дуже подібним для обох партій насіння (А та В) у необробленому стані (T50% означає середній час для 50% проростання та складає 151 год для партії А та 157 год для партії B і не суттєво відрізняється (P > 0,05)). Різні способи обробки («відшліфоване» та «відшліфоване + промите») також однаково підвищили швидкість проростання насіння обох партій (Рис. 2). Шліфування збільшило проростання (Т50% значно (Р < 0,05) нижче, ніж в необробленого насіння), що свідчить про те, що видалення тканини перикарпу усуває можливе механічне обмеження проростання та/або зменшує кількість інгібуючих сполук. Комбінована обробка (шліфування + промивання) дала найкращі результати для обох партій із значно (Р < 0,05) нижчим Т50%, порівняно з необробленим та відшліфованим насінням. Це переконливо свідчить про те, що зменшення тканини перикарпу носить фізіохімічний характер і може бути викликане додатковим видаленням інгібіторних сполук шляхом промивання насіння.

Крім покращення проростання, якості насіння та, в кінцевому підсумку, врожайності, найважливішим моментом технологій промислової обробки насіння є підтримка розвитку «нормальних» сходів. Звичайні сходи — це ті, які мають високу ймовірність вирощуватися досить інтенсивно, щоб їх можна було використовувати безпосередньо як молоді сходи (наприклад, червоного буряка) або для вирощування цукрових буряків у польових умовах. Рис. 3 показує, що різні види обробок також впливали на зовнішній вигляд сходів. Після інкубаційного періоду, що тривав 13 днів при 10°C, а потім ще 3 дні при 20°C, тільки необроблене насіння з партії А не дало сходів (3,0% ± 1,3). Загалом, ненормальні сходи з’явилися у більшій кількості (Р < 0,05) у партії А, ніж у партії В. Найбільша частка (Р < 0,05) ненормальних сходів спостерігалася у необробленого насіння (партія А 32,5% ± 1,7 та партія В 12,5% ± 1,0), що значно зменшується застосуванням шліфування або «шліфування + промивання». Після шліфування + промивання спостерігалися нормальні сходи майже для кожної насінини (Рис. 2).

Таблиця 1. Зведені дані (середнє значення ± SE) маси та вологості насіння Beta vulgaris

Технологія обробки насіння Маса 1000 насінин (г) Зменшення маси перикарпу після шліфуванняa (%) Зменшення розміру (площа поперечного перерізу)b (%) Вміст вологи (% DW)

Партія A
Необроблене
Відшліфоване

Відшліфоване + промите


18.1 ± 0.3
13.2 ± 0.1
13.1 ± 0.1


n/a
35,3
36,2


n/a
44,4
42,7


8.7 ± 0.2
8.6 ± 0.1
8.3 ± 0.1

Партія В
Необроблене
Відшліфоване

Відшліфоване + промите


15.9 ± 0.2
12.3 ± 0.1
12.0 ± 0.1


n/a
31,1
33,8


n/a
48,6
48,7


8.5 ± 0.1
8.5 ± 0.3
8.5 ± 0.2

Рис. 2. a Кінетика проростання насіння цукрових буряків, інгібованого при 10°С у темряві, партій А та В. Вісь x показує тривалість інгібування, а вісь y — відсоток пророщеного насіння. Показники схожості необробленого (сірий), відшліфованого (помаранчевий) та відшліфованого + промитого (синій) насіння. Обробка скорочує час до досягнення 50% проростання (Р < 0,05) для обох партій. Кожна точка на графіку являє собою середнє значення ± SE 4 × 50 насінин.

Рис. 3. Частка нормальних/ненормальних сходів цукрових буряків з необробленого, відшліфованого та «відшліфованого + промитого» насіння. Кількість сходів у кожній категорії реєстрували через 13 днів при 10°C після ще 3 днів при 20°C. Сходи, отримані з повністю обробленого насіння, мають, як правило, нормальну фізіологію розвитку та росту корінця та гіпокотилю (синя рамка). Сходи, отримані з необробленого насіння, дають більше (Р < 0,05) ненормальних сходів, які є заторможеними, неправильно сформованими або мають затемнені корінці та гіпокотилі (червона рамка). Показано зразки сходів для обох категорій. Кожен стовпчик являє собою середнє значення ± SE 4 повторів по 50 насінин.

Пригнічення проростання насіння за допомогою промивної води перикарпу

Щоб визначити негативний вплив розчинних молекул, що містяться в перикарпі, був проведений експеримент, який показав, наскільки водорозчинні екстракти з подрібненого перикарпу ("промивна вода") партій А та В можуть гальмувати проростання насіння. Відшліфоване та промите насіння обох партій поглинало промивну воду перикарпу, отриману з обох партій окремо (Рис. 4). Ці спостереження порівнювалися з відомими гнітючими умовами: гормональним внесенням абсцизової кислоти (AБК), розчину солі (NaCl) та контролем (dH2O). Вимірювалася осмоляльність та провідність промивної води A (30 ± 1 мОсм/кг H2O та 1,9 ± 0,1 мСм/см) та промивної води B (55 ± 3 мОсм/кг H2O та 4,0 ± 0,1 мСм/см) для 100 ммоль NaCl (192 ± 3 мОсм/кг H2O та 11,2 ± 0,1 мСм/см), 50 ммоль NaCl (94 ± 2 мОсм/кг Н2О та 5,8 ± 0,1 мСм/см) та 25 ммоль NaCl (46 ± 1 мОсм/кг Н2О та 2,9 ± 0,1 мСм/см). Поглинання промивної води перикарпу значно (Р < 0,05) уповільнювало проростання «відшліфованого + промитого» насіння обох партій (Рис. 4). Спостережувані інгібуючі впливи кількісно оцінювалися та порівнювалися шляхом розрахунку збільшення часу, необхідного для завершення 50% проростання. Затримка проростання, спричинена поглинанням промивної води перикарпу, виявлена в необробленого насіння партії В, була більшою (Р < 0,05), порівняно з необробленим насіння партії А (Рис. 4).

Затримка 50% проростання "відшліфованого + промитого" насіння партії А склала 52 год для промивної води А та 98 год для промивної води В, а в партії В — 45 год і 96 год відповідно. Якщо порівнювати гормон, що пригнічує проростання, тобто абсцизову кислоту (АБК) та розчин солі (NaCl), інгібуючі впливи промивної води, отриманої з перикарпу партії А, відповідали 100 мкмоль АБК та 100 ммоль NaCl. Ці інгібуючі розчини та промивна вода з партії А спричинили подібну затримку проростання для обох партій «відшліфованого + промитого» насіння (для насіння партії А 50% проростання затримувалося у промивній воді А на 52 год, 100 мкмоль АБК — на 35 год і 100 ммоль NaCl — на 53 год, а насіння партії В — 45 год, 48 год та 58 год відповідно). Промивна вода, отримана з перикарпу партії В, показала набагато сильнішу (P < 0,05) затримку проростання «відшліфованого + промитого» насіння обох партій (98 год — для насіння партії А та 96 год — для насіння партії В), порівняно з 100 мкмоль АБК та 100 ммоль NaCl (Рис. 4). Висновок свідчить про те, що необроблені перикарпи партії В містили значно більше інгібіторних водорозчинних сполук, порівняно з необробленими перикарпами партії А, і що вони ефективно видалялися шляхом шліфування та промивання насіння. Цікаво, що результати аналізу провідності та осмоляльності для обох зразків промивної води були значно нижчими, ніж результати для 100 ммоль NaCl, але були досить порівнювані зі значеннями між 25 та 50 ммоль NaCl. Це спостереження показує, що іони дійсно сприяють пригніченню проростання, але не є основним його чинником.

Рис. 4. Кінетика проростання насіння цукрових буряків, просоченого промивною водою перикарпу, АБК або NaCl при температурі 10°С у темряві. Відсоток пророслого відшліфованого і промитого насіння реєстрували протягом 550 год витримування у водному екстракті (промивній воді) з перикарпу необробленого насіння партії А (у синьому кольорі, заповнені) або партії В (у синьому кольорі, відкриті). Порівняння показників проростання в розчинах промивної води перикарпу з трьома контролями: dH2O (зелений); 0,1 ммоль абсцизової кислоти (АБК) (помаранчевий) і 0,1 моль хлориду натрію (NaCl) (червоний). Вісь x показує тривалість поглинання, а вісь y — відсоток пророслого насіння. Кожна точка вимірювань являє собою середнє значення ± SE щонайменше 3 повторів по 25 насінин.


1155