Багатогранна ефективність використання хітозану та триходерми на цукрових буряках

 

Біоактивна молекула хітозан (CHSN) викликає значний резонанс, так як вважається одним із найефективніших природних антимікробних агентів. Активність хітозану залежить від його молекулярної маси (ступінь полімеризації (DP) складає кілька сотень кДа до олігохітозанів, таких як гексамери); ступінь деацетилювання (DA), що залежить від pH (при pH 6,0 більшість аміногруп знаходяться у лужній формі); та цільовий мікроорганізм (зниження ефективності: дріжджі > цвілевий грибок > грампозитивні бактерії > грамнегативні бактерії). Запропоновані механізми включають дестабілізацію мембрани та проникність господаря. Хітоолігосахариди і дуже низькомолекулярні хітозани виробляються в основному для терапевтичних цілей, тоді як більш в’язкі молекули (висока молекулярна маса, HMW) використовуються у харчових та волоконних технологіях. Важливо відзначити, що хітозан та його похідні вважаються сильними антимікробними та зміцнюючими засобами захисту рослин, які можна порівняти з агентами біологічного контролю (BCA). Ще однією перевагою використання хітозану є його GRAS-статус (визнаний повністю безпечним), що може полегшити його реєстрацію.

За матеріалами статті на тему «Багатогранна ефективність хітозану та триходерми на цукрових буряках» («The Multilateral Efficacy of Chitosan and Trichoderma on Sugar Beet») журналу «Journal of Fungi» («Журнал про гриби»), січень 2022 р.

Індукція системної стійкості хітозану в рослинах вивчається протягом кількох років. Наприклад, замочування насіння, нанесення на корені або розпилення продуктів хітозану стимулюють захисні механізми у рослин, тим самим підвищуючи їх стійкість до патогенів та одночасно посилюючи ріст.

Рід грибів Trichoderma відомий як багатообіцяючий інструмент біологічного контролю. З цією метою корисні для рослин гриби роду Trichoderma в першу чергу визначаються їх антагонізмом проти рослинних патогенів, активацією системи захисту в рослин і як умовно-патогенні симбіонти, які підвищують системну стійкість рослин. Насправді, майже 90% грибкового складу агентів біологічного контролю (BCA) і більше 60% біофунгіцидів містять гриби роду Trichoderma, тоді як органічні добрива на основі Trichoderma набувають все більшого поширення через їх простішу реєстрацію. Trichoderma застосовується для обробки насіння, ґрунту або листя, у якості біо-/мікофунгіцидів, біостимуляторів росту рослин та органічних добрив. Застосування Trichoderma на рослинах стимулює місцеві та системні захисні реакції, які включають сигнальні каскади, а також накопичення в рослинах захисних антимікробних сполук і ферментів.

Одним із таких багатообіцяючих агентів біологічного контролю (BCA) є мікопаразит Trichoderma atrovirid. Мікопаразитарні реакції викликаються молекулами, що вивільняються з гриба-хазяїна (компоненти, що вивільняються в результаті деградації клітинної стінки) або через фізичний контакт, що здійснюється через компоненти, розташовані на поверхні (наприклад, лектини). T. atrovirid пригнічує або вбиває хазяїна, гідролізуючи та паразитуючи на його гіфах через ферменти, що руйнують клітинну стінку. Нещодавно було виявлено, що ферменти, які модифікують клітинну стінку, такі як хітиндеацетилази, хітозанази та хітинсинтази, беруть участь у ремоделюванні клітинної стінки та значною мірою сприяють мікопаразитизму. Крім того, вторинні метаболіти, включаючи пептиди та летючі сполуки, діють проти грибкових патогенів, активуючи захисну реакцію рослин на стрес та/або покращуючи морфологію та фізіологію кореневої системи.

В останні роки поєднання агентів біологічного контролю (BCA) з антимікробними/біоцидними сполуками, такими як хітозан, стає все більш актуальним. У більшості досліджень комбінований ефект застосування хітозану з іншими антимікробними агентами або агентами біологічного контролю (BCA) збільшується у контексті синергічних протимікробних ефектів хітозану. Крім того, комбінація хітозану (або хітозанового олігомеру) та штаму альбіносів T. harzianum пригнічує проростання спор і, отже, утворення колоній рослин-патогенів Leptographium procerum або Sphaeropsis sapinea.

Через свій високий потенціал ураження хвороба плямистості листя Cercospora (CLS), викликана Cercospora beticola, є постійною загрозою для виробництва цукрових буряків. Церкоспороз серйозно вражає більше третини посівних площ цукрових буряків у всьому світі.  

Скорочення врожайності цукрових буряків через зараження церкоспорозом становить приблизно 20% на рік. Зазвичай у боротьбі з церкоспорозом застосовуються обприскування полів фунгіцидами три-п’ять разів на рік, що негативно впливає на навколишнє середовище та викликає розвиток стійкості у грибів. Таким чином, збільшується необхідність застосування природних та безпечних альтернатив, ефективних у контролі церкоспорозу. Крім того, у зв’язку з глобальним потеплінням необхідно докладати більше зусиль для підтримки сталого розвитку сільського господарства за допомогою нових наукових досягнень в екологічних стратегіях та біологічному контролі.

Незважаючи на доведену користь для рослин, поки що лише кілька досліджень стосувалися застосування штамів Trichoderma для стимулювання стійкості цукрових буряків до патогенів і лише одне з них досліджувало Trichoderma як потенційний агент біологічного контролю (BCA) у боротьбі з церкоспорозом.

У даному дослідженні оцінювалася здатність T. atroviride та хітозану стимулювати ріст та механізми захисту у B. vulgaris проти патогенів (C. beticola, CLS) у лабораторних та польових умовах. Досліджувалося дражування насіння та позакореневе внесення агентів біологічного контролю (BCA) T. atroviride та хітозану. Крім того, специфічність важливих патогенів щодо господаря цукрового буряка, таких як C. beticola, Fusarium spp., Penicillium spp. та Aspergillus versicolor, була визначена за допомогою хітозанів різної молекулярної маси.

Хітозан пригнічує ріст рослинних патогенів

Визначалася здатність хітозану з різною молекулярною масою пригнічувати ріст основних фітопатогенів у рослинництві, з особливим акцентом на вирощуванні B. vulgaris. Дослідженими грибковими збудниками були чотири види Fusarium, два види Penicillium, A. versicolor, S. sclerotiorum, B. cinerea, R. solani та C. beticola, які є широковідомими шкідниками в сільському господарстві.

Результати досліджень підтвердили сильну біоцидну дію та високу фунгіцидну дію хітозану майже на всіх досліджуваних патогенах. Хітозан низької (LMW) і (HMW) високої молекулярної маси виявилися найбільш ефективними і показали пригнічення росту патогенів від 60% до 80% для C. beticola і B. cinerea та від 80% до майже 100% для Fusarium протягом тривалого часу інкубації до 12 днів. Ріст Penicillium також сильно пригнічується цими хітозанами. З іншого боку, хітозан практичного класу (PG) виявився менш ефективним для притуплення росту цих патогенів.

R. solani лише помірно (на 20%) пригнічувалася всіма класами хітозанів, а хітозан високої молекулярної маси (HMW) показав 35% інгібування S. sclerotiorum та близько 50% інгібування хітозанами низької молекулярної маси (LMW) і хітозаном практичного класу (PG).

Комбіноване застосування T. atroviride і хітозанів виявляє адитивний фунгіцидний вплив на патогени

Щоб визначити, чи може поєднання T. atroviride та хітозану збільшувати пригнічення фітопатогенів, спочатку потрібно було оцінити, чи здатна T. atroviride рости в середовищі, доповненому хітозанами. Для цього T. atroviride поміщали в PDA, що містило 2 мг/мл-1 хітозанів, обстеження її росту проводилося через 3 та 6 днів. Цікаво, що спочатку ріст T. atroviride порушувався, але через 6 днів вся чаша покрилася міцелієм, після чого почалося продукування зрілих зелених конідій. Можна зробити висновок, що T. atroviride може закріпитися в присутності великої концентрації хітозану різних класів. З іншого боку, у рослинних патогенів, чутливих до хітозану, не було виявлено адаптації до нього навіть після тривалого часу інкубації.

Далі порівнювався колоніальний ріст патогенів C. beticola, F. oxysporum, B. cinerea та S. sclerotiorum за наявності та відсутності T. atroviride, доповненим одним із трьох класів хітозану. Результати показали значне посилення фунгіцидної дії при поєднанні T. atroviride і високомолекулярного (HMW) хітозану або практичного класу (PG) хітозанів. Спільне вирощування T. atroviride в контрольному середовищі та середовищі, доповненому практичним класом (PG) хітозанів, викликало аналогічне підвищення пригнічення розвитку всіх досліджуваних патогенів. Найкраща ефективність проти C. beticola спостерігалася під час застосування високомолекулярного (HMW) хітозану, з подальшим збільшенням інгібування хвороби на 17% за рахунок наявності T. аtroviride, що призвело до загального пригнічення церкоспорозу на 93%. Високомолекулярний (HMW) хітозан і T. atroviride викликали стабільний фунгістаз на C. beticola. Поєднання високомолекулярного (HMW) хітозану з агентом біологічного контролю (BCA) також призвело до збільшення на 19% пригнічення росту S. sclerotiorum, але загальне пригнічення гриба досягло лише 50%, подібно до інших випробувань з низькомолекулярним (LMW) хітозаном або з хітозаном практичного класу (PG). Інгібування росту B. cinerea та F. oxysproum високомолекулярним (HMW) хітозаном не змогло сильно збільшитися при його поєднанні з T. atroviride. Крім того, комбінація з низькомолекулярним (LMW) хітозаном показала лише незначний адитивний або синергетичний ефект на досліджених штамах або взагалі відсутність будь-якого ефекту. Важливо зазначити, що інгібування цих патогенів лише низько- (LMW) і високомолекуляним (HMW) хітозанами вже є дуже високим і, таким чином, подальше його збільшення, швидше за все, не таке помітне при високій концентрації хітозанів (CHSN). З іншого боку, збільшення пригнічення росту B. cinerea хітозанами LMW або HMW було менше вираженим, але сильний вплив T. atroviride та адитивних хітозанів на ріст B. cinerea та S. sclerotiorum показано на прикладі того факту, що патогени, схоже, намагаються уникнути антагоніста, що можна спостерігати в місцях протистояння колонії B. cinerea проти низькомолекулярного (LМW) хітозану.

Хітозан стимулює проростання B. vulgaris

Щоб оцінити вплив хітозану на розвиток сходів, насіння оброблялося 10 мг/мл високомолекулярним (HMW) хітозаном або підкисленою водою (рН 5,6) у якості контрольного зразку. Визначалося проростання (GE) і відсоток схожості (GP) через 48 годин, 72 години і 120 годин та розрахувався показник схожості насіння (GI). Відсоток схожості відображає густоту посіву насіння і був значно вищим на 2-й, 3-й і 5-й день у насіння, обробленого хітозаном, порівняно з контрольними умовами, з підвищенням схожості на 15% +/- 5% через 5 днів. Схожість із використанням хітозану перевищувала схожість у контрольних умовах. Спостерігається «ранній» або прискорений початок проростання (на 33% швидше через 48 год) при праймуванні насіння хітозаном, порівняно з контрольними умовами. Крім того, показник проростання насіння, покритого хітозаном, склав 17,38%, порівняно з 13,02% у контрольних умовах. Крім того, було виявлено збільшення свіжої маси сходів обробленого хітозаном насіння на 17%. Цікаво, що це збільшення було пов’язане зі збільшенням росту коренів у довжину, а не з розвитком пагонів, оскільки корені та гіпокотиль мали на 30% більшу масу, порівняно з контрольними умовами, тоді як пагони сильне не відрізнялися. У даних експериментах обробка насіння хітозаном підвищувала його схожість і сприяла ранньому розвитку сходів.

Таблиця 1. Проростання B. vulgaris

Обробка GP GE (48 год) GE (72 год) GE (120 год) GI (5 днів)
Контроль 69,0 ± 4,9 11,25 ± 1,6 14 ± 1,3 13,8 ± 1,0 13,02 ± 1,29
CHSN 84,5 ± 3,0 17,25* ± 1,8 18* ± 1,0 16,9* ± 0,6 17,38* ± 1,14

Значення виражені як середня стандартна похибка. * Дані значно відрізняються при p < 0,05. n = 100 у 2 технічних повтореннях. GP — відсоток схожості (схожість через 5 днів (%)); GE — проростання (ефективність проростання (%) на добу); GІ — показник схожості насіння (середнє значення схожості (%) за добу за 5 днів).

T. atroviride і хітозан позитивно впливають на ріст B. vulgaris

Для порівняння ефекту обох біологічно активних сполук молоді рослини B. vulgaris у стадії шести листків оброблялися трьома різними препаратами: 1 мг/мл високомолекулярним (HMW) хітозаном (CHSN, pH до 4,5); спорами T. atroviride (104 спори, мл-1); та, у якості контролю, дистильованою водою, доведеною до рН 4,5. Ріст і життєздатність рослин контролювалися з трьома обробками протягом 40 днів. Обробка листя розчином спор T. atroviride і високомолекулярним (HMW) хітозаном призвела до швидшого та кращого росту, інтенсивнішого забарвлення листя та більшої площі поверхні листя, порівняно з контрольними умовами. Цей ефект посилювався за допомогою другої і третьої обробок.

Після обробки хітозаном спостерігалися сильні, зелені та розвинені рослини. Можна припустити, що інтенсивний ріст міг бути викликаний стабільно високим тургором листя в оброблених рослин.

Отримані дані вказують на те, що системна резистентність індукується у B. vulgaris після першої листкової обробки хітозаном або T. atroviride і стабільно підтримується після другої обробки.

Обговорення

C. beticola викликає церкоспороз — одну з найбільш шкодочинних хвороб листя цукрових буряків в усьому світі. Часте застосування фунгіцидів, переважно хіміко-синтетичного походження, продовжує залишатися основним засобом боротьби з церкоспорозом. Виведення нових гібридів із підвищеною генетичною стійкістю є ефективним способом боротьби з хворобою, хоча при цьому може знижуватися врожайність або якість кінцевого продукту. Не в останню чергу для того, щоб відповідати правилам та цілям сталого розвитку, протягом останніх десятиліть були докладені значні зусилля для просування сталого агенту біологічного контролю (BCA).

У даному дослідженні розглядалися та порівнювалися дві багатообіцяючі альтернативи звичайним фунгіцидам, а саме — біоцидний природний продукт хітозан та агент біологічного контролю (BCA) T. atroviride. Отримані результати підтвердили їхній високий потенціал у стимулюванні росту цукрових буряків (B. Vulgaris) і дали нове уявлення про значне зниження розвитку церкоспорозу. Результати досліджень показують, що низько- (LMW) та високомолекулярний (HMW) хітозан у концентрації 2 мг/мл є високоефективним проти ряду основних грибкових патогенів, включаючи чотири види Fusarium, два Penicillium, B. cinerea та C. beticola. Це узгоджується з іншими нещодавно опублікованими висновками щодо грибкових патогенів, включаючи F. oxysporum та інші види Fusarium, B. cinerea, Rhizopus, Phytophthora та Alternaria. Усі види хітозану пригнічували R. solani лише на 20%, що підтвердили вище описані результати. Порівняння трьох різних видів хітозану дозволило виокремити найбільш ефективний із них у боротьбі проти усіх досліджених патогенів. Найменшу ефективність показав хітозан практичного класу (PG), але найперспективнішими біоцидними агентами з високою фунгіцидною дією виявилися низько- (LMW) та особливо високомолекулярний (HMW) хітозани, які пригнічували розвиток C. beticola та всіх видів Fusarium на 80 - майже 100%.

Однією з важливих тенденцій біологічного контролю є застосування комбінацій агентів біологічного контролю (BCA) або поєднання BCA з біоцидним природним агентом. Перед їх застосуванням необхідно визначити потенційний синергізм, адитивні ефекти або антагонізм, оскільки це допоможе визначити найкращий спосіб їх застосування та поєднання. З цією метою досліджувалося, як хітозан впливає на мікопаразитарну поведінку Trichoderma.

Цікаво, що в конфронтаційному аналізі комбінованої активності хітозану та T. atroviride спостерігався сильний синергетичний ефект для інгібування росту основних патогенів рослин, включаючи C. beticola та F. oxysporum. Комбінація високомолекулярного (HMW) хітозану з T. atroviride викликала найстабільніший фунгістаз у C. beticola, збільшившись на 17% — до майже повного пригнічення 93%. Більш слабке інгібування хітозаном практичного класу (PG), швидше за все, пов’язане з його менше вираженою природою, і, таким чином, збільшення інгібування в основному пов’язане з наявністю T. atroviride і лише невеликим адитивним ефектом самого хітозану.

Високомолекулярний (HMW) хітозан виявився високоефективним проти більшості досліджуваних патогенів, також було показано, що він, як активатор захисних механізмів у рослин, сприяє їх росту та стійкості до патогенів.

Цукрові буряки, оброблені спорами T. atroviride, та особливо рослини, оброблені хітозанами, показали прискорений ріст із посиленим забарвленням листя та більшою площею поверхні листя. Важливо, що кожна подальша обробка збільшувала спостережуваний позитивний вплив на стан рослин. Застосування Trichoderma підвищує стійкість до абіотичного стресу, такого як стрес від посухи та сольовий стрес. Протягом експерименту рослини стикалися з високими температурами протягом липня і серпня, і було показано, що обробка хітозаном також покращує їх стійкість до теплового стресу.

У рослин, оброблених хітозаном, було виявлено виділення фітоалексину та фенольних попередників, підвищення виробництва хітинази та зниження рівня афлатоксинів разом з іншими факторами, що мають значення для захисту рослин. Крім того, позакореневе обприскування Trichoderma зменшило розвиток церкоспорозу на цукрових буряках. У тепличному експерименті повторне листкове підживлення спорами T. atroviride або хітозаном викликало захисні реакції у B. vulgaris і значно знизило прояв церкоспорозу. Рослини, оброблені хітозаном, були на 47% менше інфікованими, а рослини, оброблені спорами T. atroviride, виявилися на 27,9% менше інфікованими церкоспорозом. Крім викликання захисних реакцій у рослин, хітозан сам проявляє високу внутрішню протигрибкову активність. Можна зробити висновок, що простого багаторазового застосування листкового обприскування потужним протигрибковим і захисним агентом хітозаном буде цілком достатньо для значного зниження розвитку церкоспорозу на цукрових буряках.

Замість інокуляції ґрунту спорами T. atroviride, обприскування листя запускає захисний механізм у B. vulgaris, а також значно підвищує стійкість буряків до інвазії найвідомішим шкідником церкоспорою. Системна індукція активності хітинази в листі цукрових буряків після обробки різними ізолятами Trichoderma була пов’язана зі зниженням розвитку церкоспорозу.

Хітин-специфічні рецептори в рослинах розпізнають хітин та його похідні, коли вони вивільняються при взаємодії з грибковими патогенами, після чого викликають захисні реакції. Відповідно, обробка на основі хітину активує захисний механізм у рослин, імітуючи атаку патогена.

Церкоспорин, що продукується C. beticola, під впливом світла призводить до утворення активних форм кисню (АФК), які, в свою чергу, використовуються церкоспорозом для руйнування клітинних мембран рослин. Збільшення експресії антиоксидантного гена, що спостерігалося в експериментах, є сильним показанням для детоксикації утворених АФК у B. vulgaris, оброблених високомолекулярним (HMW) хітозаном. Крім того, пероксидази можуть використовувати АФК для збільшення лігніну і, таким чином, товщини клітинної стінки шляхом окислення фенольних сполук.

Обробка насіння забезпечує захист на перших етапах його проростання та розвитку сходів, коли насіння та сходи найбільш вразливі і не можуть в повній мірі захистити себе від патогенів. Перш за все, хітозан з його плівкоутворюючими, в’язкими властивостями ідеально підходить для обробки насіння.

Позитивний вплив хітозану на проростання, ріст та стан рослин було раніше описано для кількох рослин; проте, наскільки нам відомо, обробка насіння B. vulgaris хітозаном не досліджувалася. В аналізі обробленого хітозаном насінням було виявлено позитивний вплив високомолекулярного (HMW) хітозану на ефективність його проростання. Через 5 днів спостерігалося збільшення загальної схожості на 15%. Можна припустити, що тривалий ефект, що призводить до збільшення розвитку та маси буряків, також може позитивно впливати на вихід цукру.

Trichoderma використовується в основному перед посівною для обробки насіння і, подібно до обробки хітозаном, було показано, що вона покращує схожість рослин, їх індекс життєздатності та захисний механізм. Обробка насіння B. vulgaris спорами T. atroviride позитивно впливає на експресію генів, пов’язаних із захистом рослини. Деякі види Trichoderma здатні проникати в епідерміс і демонструють тривалу колонізацію поверхонь коренів, що, у свою чергу, призводить до зміни рослинного метаболізму та профілю експресії. Колонізацію T. atroviride було виявлено на коренях та нижній частині гіпокотилі сходів, тоді як на поверхні самих сходів нічого їх не було.

Хітозан є чудовим кандидатом для заміни або доповнення звичайних фунгіцидів, сприяючи проростанню насіння, підтримуючи ріст та розвиток рослин, а також викликаючи множинну системну резистентність. Хітозан має біоцидну імуностимулюючу дію, тоді як спори T. atroviride переважно індукували експресію гена захисту, пов’язаного зі стресом у B. vulgaris. Розвиток церкоспорозу ефективно зменшувався за допомогою обробки насіння хітозаном і, меншою мірою, спорами T. atroviride під час позакореневого підживлення, але обидві діючі речовини виявляли виражений репелентний ефект проти комах-шкідників. Ми припускаємо синергетичний ефект T. atroviride і, зокрема, високомолекулярного (HMW) хітозану на інгібування відповідних патогенів цукрових буряків через посилення експресії ферментів, асоційованих із мікопаразитизмом. Обидва агенти також можуть діяти синергетично через різні сигнальні шляхи, що може бути дуже корисним для їх комбінаторного (і, таким чином, додаткового) застосування. Таким чином, обприскування Trichoderma, у поєднанні з екзогенним хітозаном, можна використовувати як потужний інструмент для контролю розвитку посівів.

Результати проведених досліджень показали, що обробка насіння B. vulgaris та профілактичне підживлення посівів хітозаном сприяє їх росту та резистентності, експресії генів захисту та зменшує розвиток церкоспорозу. Результати дослідження комбінації високомолекулярного (HMW) хітозану та T. atroviride підкреслюють їхній значний потенціал, імовірно, створюючи основу для майбутнього прогресу в їх комбінованому використанні в біологічному контролі.


748